張會(huì)敏，王艷麗，孟雅靜，李安軍，周慶伍，胡心行，劉國(guó)英，李 蘭，黃 艷，邢新會(huì)

（1.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽 亳州 236820；2.清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084）

濃香型窖泥中富含大量厭氧菌群[1]，對(duì)提高白酒發(fā)酵質(zhì)量具有重要作用[2]?，F(xiàn)已知窖池越老窖泥菌群越豐富[3]，酒質(zhì)越好。Deng Bo等[4]發(fā)現(xiàn)窖泥菌群內(nèi)部復(fù)雜合作和抑制關(guān)系導(dǎo)致窖泥菌群結(jié)構(gòu)的進(jìn)化演變。Tao Yong等[3]研究了1、10、25、50 a窖齡窖泥菌群的變化，發(fā)現(xiàn)窖泥至少需25 a達(dá)到老熟。Liu Maoke等[5]也進(jìn)一步證實(shí)40 a與400 a窖齡的窖泥菌群結(jié)構(gòu)差異不明顯。由此可知，窖泥菌群需要25 a達(dá)到老熟狀態(tài)。在窖泥菌群老熟過程中，窖泥菌群與其所在的理化環(huán)境相互適應(yīng)、相互影響。由于池底泥與池壁泥所處的理化環(huán)境截然不同，因此有必要將池壁泥和池底泥分開研究，對(duì)詳細(xì)了解窖泥的老熟具有重要作用。目前，只有Ding Xiaofei等[6]通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）研究發(fā)現(xiàn)池底泥中真細(xì)菌的菌群豐度大于池壁泥，兩者真細(xì)菌的菌群組成不同，兩者古菌（主要為甲烷菌）的組成類似。但是，由于PCR-DGGE研究方法的限制，并沒有給出詳細(xì)的菌群組成。在實(shí)際釀酒中，一般分層出醅分層蒸酒，靠近池底泥的下層酒醅出酒的酒質(zhì)普遍好于上層酒醅出酒的酒質(zhì)，即池底泥菌群更有利于提高釀酒質(zhì)量。在釀酒過程中，糧食等原材料經(jīng)微生物分解代謝形成黃水，黃水沉積在池底，給池底泥帶去了豐富的營(yíng)養(yǎng)和水分。隨著黃水水位提高，池底泥和池壁泥中的厭氧菌隨著黃水相互流通、相互影響。因此，池壁泥與池底泥菌群的老熟程度差異對(duì)酒的品質(zhì)具有影響。了解池壁泥與池底泥的原核微生物組成差異與理化性質(zhì)差異，分析兩者的關(guān)系，有助于分析窖泥老熟的關(guān)鍵因素。

鑒于目前有關(guān)池壁泥與池底泥菌群的比較研究很少，本研究選取安徽省北部某知名濃香型白酒公司的新窖池（5 a窖齡）和老窖池（50 a以上窖齡）的窖泥作為研究對(duì)象，對(duì)池底泥與池壁泥宏基因組的16S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序，深入分析新老窖池池壁泥與池底泥的理化性質(zhì)和原核微生物群落結(jié)構(gòu)（包括真細(xì)菌和古菌），并建立窖泥理化性質(zhì)與原核微生物群落之間的冗余相關(guān)分析（redundancy analysis，RDA），分析新老窖池池底泥與池壁泥菌群差異的原因，為綜合的窖泥改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣本取自安徽某知名濃香型白酒企業(yè)；Omega土壤DNA提取試劑盒（D5625） Omega bio-tek公司；T-vector質(zhì)粒（B522211） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Pikoreal實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）儀、ICS5000＋離子色譜儀（配ICS-5000＋ -DC電導(dǎo)檢測(cè)器）美國(guó)ThermoScientific公司；6890氣相色譜儀（配CP-WAX 57 CB色譜柱50 m×0.25 mm，0.2 μm） 美國(guó)Agilent公司；Acquity超高效液相色譜（配二極管陣列檢測(cè)器和Waters HSS T3色譜柱100 mm×2.1 mm，1.8 μm）美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥樣本采集

選取新窖池（窖齡5 a）和老窖池（窖齡＞50 a）各6 個(gè)。于窖池底部中心點(diǎn)、1 個(gè)角點(diǎn)以及中心點(diǎn)和角點(diǎn)連線共3 點(diǎn)，分別取1 塊深度2 cm的池底窖泥混勻作為一個(gè)池底泥樣本；于4 個(gè)池壁的中心點(diǎn)（黃水最高水位線覆蓋處）取池壁泥混勻作為一個(gè)池壁泥樣本。6 個(gè)老窖池池底泥樣本（BMP_old）標(biāo)記為BMP_o1～BMP_o6；6 個(gè)老窖池池壁泥樣本（WMP_old）標(biāo)記為WMP_o1～WMP_o6；6 個(gè)新窖池池底泥樣本（BMP_young）標(biāo)記為BMP_y1～BMP_y6；6 個(gè)新窖池池壁泥樣本（WMP_young）標(biāo)記為WMP_y1～WMP_y6。置于無(wú)菌袋中，于-80 ℃貯存，待用。

1.3.2 理化性質(zhì)分析

采用烘干法[5]檢測(cè)窖泥水分。使用pH計(jì)檢測(cè)窖泥pH值（將新鮮窖泥與去離子水按照1∶5（g/mL）料液比混勻靜置后檢測(cè)[3]）。采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)銨態(tài)氮含量[7]。采用滴定法檢測(cè)總酯含量[8]。將新鮮窖泥與15%甲醇按照1∶9（g/mL）料液比混勻，30 ℃超聲處理40 min，0.22 μm濾膜過濾，使用氣相色譜檢測(cè)濾液中揮發(fā)性有機(jī)酸、酯和乙醇的含量。進(jìn)樣量1 μL，柱流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流進(jìn)樣，分流比30∶1；柱溫箱程序：初始溫度35 ℃，2 ℃/min升溫至60 ℃，保持4 min，6 ℃/min升溫至195 ℃，保持20 min；氫火焰離子檢測(cè)器溫度250 ℃。采用液相色譜檢測(cè)濾液中乳酸的含量，進(jìn)樣量1 μL，流動(dòng)相KH2PO4溶液（0.02 mol/L），柱流速0.1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm，柱溫箱30 ℃。將新鮮窖泥與去離子水1∶9（g/mL）料液比混勻，8 000 r/min離心5 min，取上清液濾膜（0.22 μm）過濾，用離子色譜儀檢測(cè)可溶性K＋與Ca2＋濃度。離子色譜柱為IonPacTM CS12A RFICTM（4 mm×250 mm），進(jìn)樣量25 μL，柱流速1 mL/min，柱溫30 ℃，流動(dòng)相甲基磺酸溶液（20 mmol/L），等濃度洗脫，檢測(cè)器為ICS-5000＋ -DC電導(dǎo)檢測(cè)器。

1.3.3 DNA提取與Illumina高通量測(cè)序

使用Omega土壤DNA提取試劑盒（D5625）提取窖泥DNA。然后，通過上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。引物為：520F（5’-7 bp barcode＋GCA CCT AAY TGG GYD TAA AGNG-3’）和802R（5’-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3’），擴(kuò)增16S V4區(qū)。25 μL擴(kuò)增體系：0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶，5 μL 5×PCR Buffer，5 μL 5×High GC Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmo/L），2 μL DNA模板，1 μL上下游引物（10 μmol/L）和8.75 μL雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化、熒光定量、構(gòu)建克隆文庫(kù)均按照試劑盒說明書進(jìn)行。確定DNA文庫(kù)合格（Agilent 2100 Bioanlyzer），按照試劑盒要求進(jìn)行Illumina MiSeq雙向測(cè)序。

1.3.4 16 S rDNA拷貝數(shù)real-time PCR絕對(duì)定量

使用16S rDNA通用引物341F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-TTA CCG CGG CTG CTG GC-3’）擴(kuò)增窖泥宏基因組DNA，得到16S rDNA混合擴(kuò)增產(chǎn)物。使用T-vector試劑盒（B522211）構(gòu)建T-vector質(zhì)粒文庫(kù)并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。通過藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑選白斑克隆用于Sanger測(cè)序，確保PCR產(chǎn)物連接成功。提取質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用于絕對(duì)定量real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。普通PCR和絕對(duì)定量real-time PCR程序相同：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。real-time PCR信號(hào)采集在72 ℃產(chǎn)物延伸階段進(jìn)行。所有標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)模板對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

原始序列去掉長(zhǎng)度＜150 bp或者＞300 bp、模糊堿基（N）數(shù)＞1、同聚堿基數(shù)目＞8，引物錯(cuò)配＞1 bp的序列（QIIME，v1.8.0）；雙向拼接（FLASH軟件v1.2.7），剔除嵌合體（USEARCH，v5.2.236）。得到優(yōu)質(zhì)序列。UCLUST聚類（97%）得到可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），認(rèn)定OTU中豐度最高的序列為代表序列。使用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132）注釋代表序列為代表OTU的注釋結(jié)果（80%可信度），形成OTU列表。去除OTU列表中序列數(shù)少于總測(cè)序量0.001%的OTU。然后將OTU列表進(jìn)行100 次抽平，取平均，四舍五入取整，得到新的OTU列表。對(duì)新OTU列表，使用Qiime軟件（v1.8.0）計(jì)算各樣本的Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)，并對(duì)unweighted和weighted uniFrac距離矩陣進(jìn)行UPGMA聚類分析并可視化（R3.3.2）。窖泥理化因子的差異顯著性分析通過SPSS（24.0）方差分析（ANOVA）實(shí)現(xiàn)。窖泥理化因子與其菌群組成之間的RDA分析通過Canoco 5實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥理化性質(zhì)

窖泥的理化性質(zhì)，即窖泥菌群所處的生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)窖泥菌群的生長(zhǎng)具有重要作用。如表1所示，4 組窖泥樣本中，BPM_old的pH值最高，WPM_young的pH值最低。與窖泥中的其余有機(jī)酸比，乳酸含量最大，且乳酸pKa值最?。?.86），說明乳酸對(duì)窖泥的pH值影響最大。通過Pearson相關(guān)性分析，證實(shí)窖泥中乳酸含量與其pH值的相關(guān)性很強(qiáng)。現(xiàn)已知乳酸桿菌[9]和瘤胃菌科[10]的一些菌屬具有降解乳酸的功能，推測(cè)乳酸的多少與菌群的降解功能有關(guān)。普遍認(rèn)為窖泥pH值與其品質(zhì)具有重要相關(guān)性，即pH值越高窖泥品質(zhì)越好[1,3]。因此，考慮到乳酸對(duì)窖泥pH值的主要影響作用，降解乳酸是提高窖泥質(zhì)量的重要途徑。4 組窖泥樣本中，BPM_old中的乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯的含量相對(duì)較少，而乙酸、己酸的含量相對(duì)較多。推測(cè)BPM_old中的菌群更傾向于代謝乙醇、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯等而生成乙酸和己酸，即濃香型白酒重要香型物質(zhì)乙酸乙酯和己酸乙酯的前體物質(zhì)。4 組窖泥樣本相比，BPM_old的銨態(tài)氮含量顯著高于其余3 組。銨態(tài)氮提供微生物生長(zhǎng)的氮源，對(duì)窖泥菌群的豐度具有重要影響。已知Aminobacterium[11-12]和Sedimentibacter[13]具有降解氨基酸提高銨態(tài)氮的功能。老窖泥（尤其是池底泥）中K＋的含量相對(duì)較高，可能與其中細(xì)菌通過運(yùn)輸系統(tǒng)積累K＋[14]有關(guān)，因此推測(cè)老窖泥中菌群豐度較高。池底泥中可溶性Ca2＋濃度顯著高于池壁泥中的濃度，一方面有可能與白酒發(fā)酵過程中形成的黃水（pH 3.2～3.5）沉積在窖池底部與池底泥中的碳酸鈣反應(yīng)有關(guān)，另一方面池壁泥與黃水反應(yīng)形成的可溶性Ca2＋也可能隨黃水集中于窖池底部。此外，BPM_old的水分顯著高于BPM_young，2 組池壁泥的水分不具有顯著差異，說明老窖池的池底泥的保水性更好。4 組窖泥的理化性質(zhì)相比，2 組池底泥的己酸、K＋和Ca2＋的值比較高且接近，說明池底泥比較適宜己酸菌的生存。新窖池的池壁泥與池底泥相比，池底泥的理化性質(zhì)更接近老窖泥，也同樣說明，池底泥更適宜菌群生存。4 組窖泥中，老窖池的池底泥的pH值、銨態(tài)氮、己酸、乙酸、K＋的值最高，而丙酸、乳酸、乙醇、己酸乙酯和乳酸乙酯的值最低，反映了老窖池池底泥菌群與環(huán)境相互作用的結(jié)果。

表1 新老窖池池底窖泥和池壁窖泥的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of BPM and WPM from old and young pits

2.2 real-time PCR絕對(duì)定量結(jié)果

圖1 4 組窖泥樣本中16S rDNA拷貝數(shù)Fig.1 Numbers of 16S rDNA copies in four pit muds

Sanger測(cè)序顯示T-vector中成功插入了長(zhǎng)度為189 bp的16S rDNA片段。BLAST結(jié)果顯示，其與一株unculturedClostridiumsp.具有100%相似性（Accession No.KR704228.1）。提取該質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過絕對(duì)定量real-time PCR檢測(cè)窖泥樣本中16S rDNA的豐度，結(jié)果如圖1所示。老窖泥的16S rDNA的拷貝數(shù)顯著高于新窖泥；新窖池中池底泥的16S rDNA拷貝數(shù)略高于池壁泥，不具有顯著性差異。本研究的新老窖泥中16S rDNA的拷貝數(shù)據(jù)與已有研究規(guī)律一致[15]。16S rDNA的拷貝數(shù)在一定程度上反映了窖泥中原核菌群的豐度?？偨Y(jié)來說，與新窖泥相比，老窖泥中的菌群豐度普遍高1～2 個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.3 窖泥原核微生物群落的α多樣性

通過高通量測(cè)序（表2），共得到1 030 680 條優(yōu)質(zhì)序列，平均長(zhǎng)度207 bp，平均29 268～49 669 條/樣本。抽平后，得到25 778～25 906 條序列/樣本。OTU聚類共得到10 935 個(gè)OTU，平均456 個(gè)OTU/樣本。平均測(cè)序覆蓋率98.6%，說明測(cè)序數(shù)目足夠代表其菌群組成。序列的注釋度（門、綱、目、科、屬）＞99.9%，說明窖泥中大量未培養(yǎng)菌實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)分類。4 組窖泥樣本中，BPM_old的OTU數(shù)目、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)值最高，WPM_young最低，與圖1結(jié)果一致。WPM_old與BPM_young相比，BPM_young中的OTU數(shù)目和Chao1指數(shù)值更大一些，不具有顯著差異；兩者Shannon指數(shù)值相當(dāng)，表明兩者菌群豐度和多樣性相當(dāng)。WPM_young的豐度和多樣性顯著低于其余3 組，表明池壁泥比池底泥的老熟速度慢，與Tao Yong等[3]的研究結(jié)論基本一致。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了新窖池的池底泥和池壁泥的巨大差異，老窖泥的原核菌群數(shù)量（16S rDNA的拷貝數(shù)）比較多且未知菌最多，說明了老窖泥菌群的復(fù)雜性。

表2 4 組窖泥樣本的原核微生物群落豐度和多樣性參數(shù)Table 2 Richness and diversity indices of prokaryotic community in four pit muds

2.4 窖泥原核微生物群落的β多樣性

如圖2所示，OTU注釋共得到25 個(gè)門，其中23 個(gè)細(xì)菌門，2 個(gè)古菌門（Euryarchaeota，WSA2）。含量超過0.1%的門有11 個(gè)。含量最多的門為后壁菌門（Firmicutes）。2 組池底泥中Firmicutes的含量相當(dāng)，BPM_old中含有更多的互養(yǎng)菌門（Synergistetes），BPM_young中含有更多的擬桿菌門（Bacteroidetes）。兩組池壁泥相比，新窖池的池壁泥中Firmicutes和變形菌門（Proteobacteria）的含量遠(yuǎn)多于老窖池的池壁泥，而老窖池的池壁泥中Bacteroidetes、Euryarchaeota和Synergistetes的含量明顯更多。Firmicutes、Bacteroidetes、Euryarchaeota、Synergistetes和Proteobacteria在各組窖泥樣本中的含量均不小于1%，為窖泥菌群中的5 個(gè)優(yōu)勢(shì)門，占總測(cè)序數(shù)的97.7%，占每個(gè)樣本的94.2%～99.6%。根據(jù)Tao Yong[3]和Liu Maoke[5]等的研究結(jié)果，老窖泥中Bacteroidetes、Euryarchaeota和Synergistetes的含量較高，而新窖泥中Proteobacteria的含量較多，與本研究的結(jié)果一致。新窖池中，池底泥與池壁泥相比較，池底泥與老窖泥更接近，說明池底泥比池壁泥的老熟速度更快。4 組窖泥樣本相比較，新窖池池壁泥中的菌群組成最單一。此外，有些菌門，其總序列數(shù)小于總測(cè)序數(shù)的0.01%，為稀有菌門，如螺旋體菌門（Saccharibacteria）和Atribacteria。

圖2 4 組窖泥樣本中含量最多的11 個(gè)門的相對(duì)含量Fig.2 Relative abundances of top 11 phyla in four pit muds

OTU注釋共得到268 個(gè)屬，總注釋度85.82%，其中BPM_old的注釋度最低（68.95%），然后依次為WPM_old（86.09%）、BPM_young（89.04%）和WPM_young（99.20%），表明BPM_old的菌群組成最復(fù)雜。其余序列被不同程度地注釋到門、綱、目、科或者無(wú)法被注釋。將含量超過1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)菌屬，4 組窖泥樣本的優(yōu)勢(shì)菌屬組成如圖3所示。2 組新窖泥相比，WPM_young的菌群組成最單一，其中只有乳酸桿菌屬（Lactobacillus，85.59%）和己酸菌屬（Caproiciproducens，5.63%），而BPM_young的菌群組成則相對(duì)更豐富，其優(yōu)勢(shì)菌屬組成種類與2 組老窖泥無(wú)異，說明池底泥的老熟速度更快。不過，BPM_young中Lactobacillus的含量（24.05%）依然顯著高于2 組老窖泥（9.18%、1.13%）。與目前普遍認(rèn)為的新窖泥中Lactobacillus的含量更高的結(jié)論一致[1,3]。Caproiciproducens是WPM_young中除了Lactobacillus之外的唯一的優(yōu)勢(shì)菌屬，推測(cè)Caproiciproducens出現(xiàn)在窖泥中比較早?，F(xiàn)已證明己酸菌和梭菌等產(chǎn)生的中長(zhǎng)鏈脂肪酸（如己酸）具有抑制Lactobacillus的功能[16]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)性分析也證明了Caproiciproducens與Lactobacillus的負(fù)相關(guān)性。推測(cè)隨著Caproiciproducens增加，其產(chǎn)生的中長(zhǎng)鏈脂肪酸（己酸、丁酸等）對(duì)乳酸菌的抑制作用增強(qiáng)，導(dǎo)致Lactobacillus的優(yōu)勢(shì)地位下降，同時(shí)老窖泥中降解乳酸的菌屬[10,17]增多，進(jìn)一步導(dǎo)致了老窖泥中乳酸的減少，進(jìn)而促進(jìn)了窖泥pH值升高，逐漸趨于中性，最終有利于噬中性菌屬（氨基酸菌Aminobacterium、沉積菌屬Sedimentibacter、甲烷菌等）的生長(zhǎng)。4 組窖泥樣本中，BPM_old中Aminobacterium的含量最高（11.85%），其次為WPM_old（2.52%），而2 組新窖泥中的含量微乎其微（0.003%～0.55%）。與Aminobacterium相比，沉積菌屬（Sedimentibacter）含量稍低，其在老窖泥中的含量也顯著高于新窖泥。窖泥中2 種豐度最高的甲烷菌為甲烷短桿菌（Methanobrevibacter）和甲烷囊菌屬（Methanoculleus），前者主要存在于BPM_young中，后者主要存在于BPM_old中。Methanobrevibacter為氫營(yíng)養(yǎng)型革蘭氏陽(yáng)性菌，以H2、CO2以及甲酸鹽為底物生成甲烷[18]。Methanoculleus為氫營(yíng)養(yǎng)型革蘭氏陰性菌，其生長(zhǎng)以乙酸作為碳源，可以使用乙醇/仲醇作為電子供體產(chǎn)生甲烷[19]。新老窖池的池底泥中甲烷菌的種類差異有可能與其中代謝功能差異有關(guān)。此外，菌屬Petrimonas在老窖池的池壁泥（15.58%）和新窖池的池底泥（10.77%）中含量都很高，具有代謝糖類生成乙酸、氫氣和CO2的功能[20]，其在BPM_old中含量并不高，也是適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。

圖3 4 組窖泥樣本中20 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)含量Fig.3 Relative abundances of 20 dominant genera in four pit muds

根據(jù)已知的菌屬的代謝功能，己酸菌（Caproiciproducens）和梭菌（Clostridium）可以通過厭氧發(fā)酵生成H2、CO2、丁酸和己酸[21-23]；互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas）可以將C4～C8的脂肪酸降解為丙酸、乙酸和H2[24]；氨基酸菌（Aminobacterium）和沉積菌屬（Sedimentibacter）可以代謝氨基酸形成乙酸和丁酸[13,25]；氫營(yíng)養(yǎng)型的甲烷菌（如Methanoculleus和Methanobrevibacter）可以轉(zhuǎn)化H2和CO2為甲烷。甲烷菌被認(rèn)為是窖泥老熟的標(biāo)志性菌[26]，甲烷菌的存在代表著窖泥菌群代謝鏈的完善，即窖泥老熟。甲烷菌的出現(xiàn)，促進(jìn)了產(chǎn)氫氣的菌（如梭菌和己酸菌）與甲烷菌之間氫轉(zhuǎn)移，同時(shí)與甲烷菌共生的Aminobacterium和Sedimentibacter的豐度增加，其降解氨基酸釋放銨態(tài)氮和乙酸的功能，一方面提供了菌群生長(zhǎng)的氮源（銨態(tài)氮）[13,25]；另一方面，又促進(jìn)了以乙酸作為生長(zhǎng)因子的甲烷菌（如Methanoculleus）的生長(zhǎng)繁殖[19]。Demirel等[27]指出氫氣的濃度達(dá)到一定程度才有利于甲烷菌轉(zhuǎn)化氫氣形成甲烷。己酸菌產(chǎn)生的氫氣是氫轉(zhuǎn)移的條件，也可能是己酸菌是除Lactobacillus之外最先出現(xiàn)在窖泥中的原因。池底泥的厭氧環(huán)境更有利于氫氣的產(chǎn)生，從而池底泥的老熟速度比池底泥快。窖泥中的氫轉(zhuǎn)移對(duì)濃香型白酒中特征風(fēng)味物質(zhì)（己酸乙酯）的前體——己酸的積累非常重要，一旦氫氣堆積，己酸（以及乙酸和丁酸）的產(chǎn)生會(huì)受阻，甚至?xí)唤到鈁28]，對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生不利。因此，老窖泥菌群代謝鏈的完善[29]，促進(jìn)了環(huán)境中乙醇、丁酸、丙酸、乳酸、己酸乙酯、乳酸乙酯含量的減少，同時(shí)促進(jìn)了銨態(tài)氮、乙酸和己酸的含量增加。乳酸和乙醇均具有抑菌功能，兩者的減少也進(jìn)一步促進(jìn)了菌群的繁殖，包括很多未培養(yǎng)菌。綜上所述，窖泥菌群所形成的代謝鏈的功能實(shí)際上是代謝窖泥中的有機(jī)物質(zhì)形成己酸的同時(shí)，并釋放甲烷或者氫氣形成厭氧環(huán)境的過程。

圖4 新老窖池池底泥和池壁泥樣本菌群加權(quán)（A）和非加權(quán)（B）unifrac距離聚類圖Fig.4 Cluster analysis of the OTU composition of old and young BPM and MBP based on unweighted (A) and weighted (B) unifrac distance

從圖4A可以看到，4 組窖泥樣本恰好聚類為4 組，說明4 組窖泥樣本中的菌屬組成差異明顯，老窖池的池底泥與老窖池的池壁泥更相近，其次為新窖池的池底泥，表明窖齡對(duì)窖泥老熟更重要，池底泥比池壁泥的老熟速度更快。由圖4B可知，4 組窖泥樣本中，BPM_old組內(nèi)差異度最小，說明BPM_old均一性比較好，而其余3 組窖泥樣本內(nèi)部的異質(zhì)性比較強(qiáng)。老窖泥菌群一致性好于新窖泥菌群的一致性，與Liang Huipeng等[30]的結(jié)論基本一致。將圖4A與圖4B相比較，可知3 組窖泥樣本的異質(zhì)性主要表現(xiàn)在菌屬組成的豐度，說明其老熟進(jìn)度不同。2 種聚類結(jié)果均表明WPM_young成熟度最低，與成熟度最高的BPM_old之間的聚類距離最遠(yuǎn)。老窖泥的原核菌群數(shù)量（16S rDNA的拷貝數(shù)）比較多，且未知菌最多，說明老窖泥菌群的復(fù)雜性。

2.5 窖泥理化性質(zhì)與菌群之間的RDA

圖5 RDA冗余關(guān)聯(lián)分析窖泥理化因子與原核菌群之間的關(guān)系圖Fig.5 Redundancy analysis of the relationship between physicochemical factors and prokaryotic communities in pit mud

圖5中箭頭的長(zhǎng)度代表相關(guān)性的大小，中心點(diǎn)和窖泥菌群之間的連線與箭頭的夾角，銳角表示窖泥菌群與相應(yīng)的理化因子呈正相關(guān)，鈍角表示負(fù)相關(guān)。2 個(gè)主成分的總解釋度88.10%，主要集中在坐標(biāo)軸1（78.29%）。以縱軸為分界點(diǎn)，左側(cè)主要為老窖池的窖泥，右側(cè)主要為新窖池的窖泥。個(gè)別老窖泥樣本出現(xiàn)在右側(cè)，如WPM_o2；幾個(gè)新窖泥樣本出現(xiàn)在左側(cè)，如BPM_y3、BPM_y6、BPM_y4和BPM_y5。BPM_old分布最集中，進(jìn)一步說明其組內(nèi)差異很小，均一度比較高，與圖4結(jié)論一致。使用互動(dòng)向前選擇程序驗(yàn)收表1中理化因子和16S rDNA拷貝數(shù)（共16 個(gè)因素），發(fā)現(xiàn)乙酸（32.9%）和水分（20.6%）對(duì)相關(guān)性的解釋度最高，具有極顯著貢獻(xiàn)（P＜0.01）。乙酸與窖泥原核菌群的強(qiáng)烈相關(guān)性，可能與其提供窖泥菌群代謝鏈的最下游底物有關(guān)；水分與窖泥原核菌群的強(qiáng)烈相關(guān)性，可能與窖泥微生物缺乏可以利用的自由水有關(guān)。參數(shù)16S rDNA拷貝數(shù)（7.9%）、己酸（7.2%）、乳酸乙酯（6.8%）和己酸乙酯（5.5%）對(duì)相關(guān)性具有顯著貢獻(xiàn)（P＜0.05）。其余10 個(gè)理化因子對(duì)相關(guān)性的解釋度均不具顯著性。與BPM_old具有強(qiáng)烈正相關(guān)的理化因子為乙酸、pH值和銨態(tài)氮，弱相關(guān)的理化因子為己酸、Ca2＋、總酯和己酸乙酯。目前關(guān)于新老窖泥菌群差異的研究[1,3]均表明pH值與優(yōu)質(zhì)老窖泥的菌群強(qiáng)烈正相關(guān)，乳酸與新窖泥或者退化窖泥的菌群強(qiáng)烈正相關(guān)。本研究將池底泥與池壁泥分開研究，發(fā)現(xiàn)乙酸和水分與窖泥菌群組成的相關(guān)性最強(qiáng)，說明在窖泥菌群老熟進(jìn)程中，乙酸具有非常重要的作用。一方面，窖泥菌群老熟過程中，有可能缺乏自由水，需要對(duì)新窖泥額外補(bǔ)充水分；另一方面，窖泥中乙酸的量可能與促進(jìn)單純氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌（如Methanobrevibacter）向乙酸營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌（如Methanoculleus）的轉(zhuǎn)變有關(guān)。乙酸營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌的存在更有利于乙酸的代謝，促進(jìn)完整代謝鏈的形成。

3 結(jié) 論

4 組窖泥的理化性質(zhì)差異明顯，其中，老窖池池底泥的pH值、銨態(tài)氮、己酸和乙酸值最高，而乳酸、己酸乙酯和乳酸乙酯值最小。4 組窖泥的原核菌群結(jié)構(gòu)相比，新窖池池壁泥的菌群組成最單一，其優(yōu)勢(shì)菌屬僅包括Lactobacillus和Caproiciproducens；老窖池池底泥的原核菌群豐度最高，其中Caproiciproducens、Syntrophomonas、Sedimentibacter、Aminobacterium和甲烷菌屬的含量都很高，而老窖池的池底泥中Lactobacillus的含量最低。窖泥理化性質(zhì)與其原核菌群結(jié)構(gòu)的RDA相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乙酸和水分與窖泥菌群的相關(guān)性的解釋度最高，表明兩者對(duì)窖泥菌群老熟具有重要作用。