陳蓬蓮，陳南泉，林河通,，林育釗，陳藝暉

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.亞熱帶特色農(nóng)產(chǎn)品采后生物學(xué)（福建農(nóng)林大學(xué)）福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后技術(shù)研究所，福建 福州 350002）

橄欖（Canarium album(Lour.) Raeusch），又名青果、青橄欖等，是中國(guó)南方亞熱帶的名特優(yōu)水果，主產(chǎn)于福建、廣東、廣西和臺(tái)灣等地[1-2]。橄欖富含多糖、氨基酸、多酚等營(yíng)養(yǎng)保健成分，具有生津止渴、開(kāi)胃健脾、助消化、除口臭等保健功效[3-4]，其鮮果及各種加工制品深受消費(fèi)者喜愛(ài)。隨著市場(chǎng)、消費(fèi)者對(duì)橄欖鮮果和加工品的需求量增大，橄欖采后病害問(wèn)題日益突顯，現(xiàn)有橄欖保鮮技術(shù)已不能滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)發(fā)展和實(shí)際生產(chǎn)的需求[5-8]。有研究表明，病原真菌侵染是引起采后橄欖果實(shí)腐爛敗壞、影響橄欖果實(shí)貨架期和降低其果實(shí)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要因素，極大地限制了橄欖果實(shí)采后的貯藏、運(yùn)輸和銷(xiāo)售[3,9-10]。Seifer[11]和Milholl[12]研究表明，病原真菌的侵染主要是通過(guò)其分生孢子從機(jī)械傷口、氣孔或者是直接穿透表皮入侵寄主，而后在寄主表面形成附著胞進(jìn)一步入侵，破壞寄主細(xì)胞，從而破壞果實(shí)表皮細(xì)胞而致使果實(shí)迅速腐爛敗壞。因此，開(kāi)展橄欖果實(shí)的潛伏侵染病害研究，對(duì)橄欖果實(shí)采前或采后的真菌病害防治，延長(zhǎng)橄欖果實(shí)貨架期，減少其經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，小孢擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis microspora）是引起采后橄欖果實(shí)果腐病和導(dǎo)致果實(shí)腐爛的主要病原菌[8,13]。目前，相關(guān)研究未能明確導(dǎo)致采后橄欖果實(shí)腐爛的主要病原菌種類(lèi)及其采前侵入時(shí)期，為了進(jìn)行橄欖果實(shí)無(wú)公害保鮮，本實(shí)驗(yàn)以福建省主栽品種‘長(zhǎng)營(yíng)’橄欖（Canarium album(Lour.)Raeusch cv.Changying）果實(shí)為研究材料，在橄欖不同生長(zhǎng)階段對(duì)其花器、果實(shí)上的真菌進(jìn)行分離和鑒定，旨在明確引起采后橄欖果實(shí)貯藏期病害的主要病原真菌種類(lèi)，并討論橄欖潛伏性真菌病害的發(fā)生規(guī)律，為控制橄欖果實(shí)采后病害發(fā)生、延長(zhǎng)其果實(shí)貯藏保鮮期和提高橄欖果實(shí)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖樣品采自福建省閩侯縣白沙鎮(zhèn)綠百合農(nóng)場(chǎng)橄欖果園（商業(yè)無(wú)污染管理果園）：在果園的不同方位選定10 棵‘長(zhǎng)營(yíng)’橄欖樹(shù)，從橄欖花期至果實(shí)成熟期（5～11月）的5 個(gè)不同生長(zhǎng)階段取樣（圖1），即從每株橄欖樹(shù)隨機(jī)摘取橄欖盛花期花器（5月28日）、幼果（6月20日）、膨大期果實(shí)（7月8日）、成熟前期果實(shí)（8月26日）和成熟期果實(shí)（11月23日）各30 個(gè)，同時(shí)也采收果實(shí)不同生長(zhǎng)階段的病葉，之后分別裝袋、貼標(biāo)簽，采收當(dāng)天運(yùn)回福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院食品貯藏保鮮實(shí)驗(yàn)室。

圖1 ‘長(zhǎng)營(yíng)’橄欖潛伏性侵染病原菌分離的5 個(gè)不同時(shí)期Fig.1 Five different stages for pathogen isolation from ‘Changying’Chinese olive

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酒精、次氯酸鈉、苯酚、氯仿、異戊醇、十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）等（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-3立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DRX-260低溫人工氣候箱 寧波江南儀器廠(chǎng)；Olympus HB光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Applied Biosystems實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 潛伏病原真菌的分離與純化

參考張居念[14]和秦士維[15]等的方法，對(duì)橄欖花器、果實(shí)進(jìn)行表面消毒，然后運(yùn)用常規(guī)組織分離法[10,16]得到組織塊、并接種在含有100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，之后放置在人工氣候箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)菌落直徑長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，用無(wú)菌接種針挑取菌落邊沿菌絲、并接種在新的PDA平板上進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)上述操作3 次，即可獲得純化菌株。

1.3.2 病原菌的致病性測(cè)定與形態(tài)鑒定

運(yùn)用科赫氏法則[17-18]進(jìn)行。采后健康的橄欖果實(shí)，經(jīng)酒精消毒、無(wú)菌水清洗晾干，用損傷接種（針刺）法，將菌餅（φ=5 mm）接種在橄欖果實(shí)表面，用塑料托盤(pán)裝接種的橄欖果實(shí)、外用聚乙烯薄膜保鮮袋密封包裝，在28 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)；以接種無(wú)菌的PDA培養(yǎng)基塊（φ=5 mm）作為對(duì)照。以上處理重復(fù)3 次。病原菌接種橄欖果實(shí)發(fā)病后，從橄欖果實(shí)發(fā)病部位再分離病原菌，并與原接種病原菌菌株進(jìn)行比較，其余橄欖果實(shí)繼續(xù)培養(yǎng)觀察、并記載發(fā)病癥狀。

將再分離的病原菌接種在PDA平板上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，根據(jù)病原菌在PDA平板上的培養(yǎng)性狀、菌落顏色、及顯微鏡下病原菌分生孢子形態(tài)、大小等特征，初步鑒定橄欖病原菌種類(lèi)，并用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)量病原菌分生孢子的大小、并拍照記錄。

1.3.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 菌絲體的收集及其基因組DNA的提取

將病原菌接種于鋪有無(wú)菌玻璃紙的PDA平板上，置于28 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，待菌落快長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)平板時(shí)，用無(wú)菌鑰匙刮取菌絲體、并用無(wú)菌水清洗3 次，然后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，運(yùn)用改良的CTAB法[19]，提取病原菌基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3.3.2 病原菌ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及其序列測(cè)定

選用真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[20-21]對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

20 μL PCR反應(yīng)體系：包括10×ExTaqbuffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 1.6 μL，引物ITS-1和ITS-4各0.8 μL，5 U/μL ExTaq0.2 μL，模板0.5 μL，ddH2O 14.1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃保持。之后用1 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電壓100 V，時(shí)間40～45 min，溴化乙錠溶液染色10 min。

參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒所介紹的方法，對(duì)目的產(chǎn)物片段進(jìn)行純化回收。PCR產(chǎn)物序列的測(cè)定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.3.3 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行BLAST分析，獲得親緣關(guān)系最近的菌株的ITS序列，運(yùn)用MEGA 6.0軟件的鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[22-24]，采用Bootstrapsjoining法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖不同生長(zhǎng)階段果實(shí)和葉片潛伏性真菌的分離結(jié)果

在橄欖果實(shí)和葉片的5 個(gè)生長(zhǎng)階段（盛花期、幼果期、果實(shí)膨大期、果實(shí)成熟前期和果實(shí)成熟期），共分離到6 個(gè)屬的真菌，分別編號(hào)GL-1、GL-3、GL-5、GL-6、GL-7、GL-8，其中以GL-8和GL-3的分離頻率最高。在橄欖5 個(gè)不同生長(zhǎng)階段的果實(shí)和葉片中，分離到的病原菌種類(lèi)和頻率有所差異（表1和表2）。其中GL-8和GL-3在橄欖果實(shí)和葉片中的分離頻率都最高，而GL-1、GL-5、GL-6和GL-7這4 種真菌的分離頻率都比較低。據(jù)此認(rèn)為，GL-8和GL-3是橄欖果實(shí)和葉片最主要的潛伏性病原真菌，在橄欖盛花期即可侵染。

進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，與果實(shí)成熟前期相比，成熟期橄欖果實(shí)中2 個(gè)主要真菌GL-8和GL-3的分離頻率下降（表1），而果實(shí)成熟期采收的葉片中GL-8和GL-3的分離頻率上升（表2）；此外，成熟期橄欖果實(shí)中GL-1、GL-5、GL-7的分離頻率上升（表1），但果實(shí)成熟期采收的葉片中GL-1、GL-5、GL-7的分離頻率下降（表2）。因此認(rèn)為，橄欖果實(shí)和葉片的病原菌之間存在相互侵染現(xiàn)象；而成熟期橄欖果實(shí)的主要病原真菌侵染源，可能是該病原真菌在橄欖葉片上越夏或越冬造成的。

表1 橄欖果實(shí)不同生長(zhǎng)階段分離的病原菌種類(lèi)及其分離頻率Table 1 Pathogens isolated from Chinese olive fruit at different development stages and their isolation frequency

表2 橄欖果實(shí)不同生長(zhǎng)階段采收的葉片分離的病原菌種類(lèi)及其分離頻率Table 2 Pathogens isolated from the leaves of Chinese olive at different fruit development stages and their isolation frequency

2.2 2 種主要潛伏性真菌的致病性測(cè)定和形態(tài)鑒定

2.2.1 GL-8

圖2 橄欖GL-8的形態(tài)特征、致病性測(cè)定及病果癥狀Fig.2 Morphological features, pathogenicity identification and fruit disease symptoms of GL-8

取無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的橄欖果實(shí)，經(jīng)表面消毒后，在橄欖果實(shí)表面接種GL-8的菌絲塊。接種后的第2天，在橄欖果實(shí)病原菌接種處出現(xiàn)水漬狀病斑；接種后的第3天，橄欖果實(shí)病斑上出現(xiàn)稀薄的灰色絮狀菌絲；接種3 d之后，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，橄欖果實(shí)的病斑逐漸擴(kuò)大，培養(yǎng)至第6天，橄欖果實(shí)全部腐爛，菌絲逐漸由灰色變?yōu)樯罨疑?。而自然未接種的橄欖果實(shí)在發(fā)病前期，其果實(shí)局部變褐色、并伴有較少的白色菌絲；在橄欖果實(shí)發(fā)病后期，整個(gè)橄欖果實(shí)表面呈深灰色且部分凹陷，橄欖果實(shí)局部出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)、并伴有灰色菌絲體。接種GL-8菌絲塊的橄欖果實(shí)病害癥狀與自然發(fā)病的橄欖果實(shí)癥狀相同（圖2A、B）；進(jìn)一步觀察證實(shí)，從GL-8菌絲塊接種的橄欖果實(shí)中再次分離病原菌GL-8，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)及分生孢子與自然分離得到的GL-8相同。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GL-8的分生孢子無(wú)色、無(wú)隔、紡錘形，大小為（18.0～28.5 μm）×（3.5～6.0 μm）（圖2F），分生孢子著生于子囊內(nèi)（圖2D），子囊著生于子囊腔內(nèi)（圖2E）。GL-8在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，最初出現(xiàn)白色氣生菌絲、而后逐漸變?yōu)榛疑缴罨疑?；在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的初期，PDA平板背面的顏色為白色，培養(yǎng)2～3 d之后，其顏色從PDA平板背面的中心開(kāi)始變?yōu)槟G色、橄欖綠，之后著色逐漸擴(kuò)展到PDA平板背面的邊緣、而且PDA平板背面的中心顏色進(jìn)一步加深，直到整個(gè)菌落都成為黑色（圖2C）。根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲和分生孢子形態(tài)特征，將GL-8初步鑒定為子囊菌門(mén)葡萄座腔菌科（Botryosphaeriacea）的小新殼梭孢（Neofusicoccum parvum）。

2.2.2 GL-3

取無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷的橄欖果實(shí)，經(jīng)表面消毒后，在橄欖果實(shí)表面接種GL-3菌絲塊。接種后的第2天，在橄欖果實(shí)病原菌接種處出現(xiàn)淡褐色并伴有微量菌絲（圖3B）；接種培養(yǎng)后期，橄欖果實(shí)表面凹陷、且產(chǎn)生大量的疏松菌絲，菌絲顏色呈白色（圖3C）。而自然未接種的橄欖果實(shí)發(fā)病前期，橄欖果實(shí)表面出現(xiàn)微量灰白色菌絲、并伴有不規(guī)則黑色斑點(diǎn)；在橄欖果實(shí)發(fā)病后期，整個(gè)橄欖果實(shí)被灰白色菌絲包裹，且菌絲體表面伴有黑色小粒分生孢子盤(pán)，橄欖果實(shí)表面凹陷、且伴有淡黃色暈圈。接種GL-3菌絲塊的橄欖果實(shí)病害癥狀與自然發(fā)病的橄欖果實(shí)癥狀相同（圖3A）；進(jìn)一步觀察證實(shí)，從GL-3菌絲塊接種的橄欖果實(shí)中再次分離病原菌GL-3，將其在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)及分生孢子與自然分離得到的GL-3相同。GL-3在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，出現(xiàn)白色的菌落及菌絲，并呈現(xiàn)花瓣式輪紋狀（圖3D）。顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，GL-3的分生孢子有5 個(gè)細(xì)胞，呈紡錘狀，中間3 個(gè)細(xì)胞呈褐色；孢子頂端無(wú)色，有2～3 根頂部附屬絲；尾部細(xì)胞無(wú)色，有1 根中生式尾毛（圖3E）。根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲及分生孢子形態(tài)特征，將GL-3初步鑒定為小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）。

圖3 橄欖GL-3的形態(tài)特征、致病性測(cè)定及病果癥狀Fig.3 Morphological features, pathogenicity identification and fruit disease symptoms of GL-3

2.3 橄欖果實(shí)主要潛伏性侵染病原菌的分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取病原菌總DNA，以通用引物ITS-1和ITS-4對(duì)分離到的6 種病原菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ribosomal gene internal transcribed spacer，rDNA-ITS）序列進(jìn)行擴(kuò)增，并將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，6 種病原菌擴(kuò)增產(chǎn)物都是單一條帶，無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，且各菌株的rDNA-ITS序列片段大小均在600 bp左右（圖4）。

圖4 橄欖果實(shí)6 種潛伏性病原菌的rDNA-ITS擴(kuò)增電泳圖Fig.4 Electrophoresis of PCR-amplified rDNA-ITS products of six latent pathogens from Chinese olive fruit

2.3.2 rDNA-ITS序列同源性比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析

運(yùn)用GenBank的序列局部相識(shí)查詢(xún)BLAST工具，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站上的GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索與上述6 株病原真菌所測(cè)得的序列相似的rDNA-ITS序列，并進(jìn)行分析比較。然后用MEGA6.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)Bootstraps法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1 000。

如表3和圖5所示，分離到的6 種病原真菌與相關(guān)屬內(nèi)參比菌株的rDNA-ITS序列相似度都為99%或100%。據(jù)此認(rèn)為，GL-1為擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、GL-3為小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）、GL-5為革菌屬（Phanerochaete）、GL-6為出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、GL-7為球座菌屬（Guignardia）、GL-8為小新殼梭孢（N.parvum）。

表3 橄欖果實(shí)病原真菌rDNA-ITS序列與相近菌株相似性比對(duì)Table 3Similarity of rDNA-ITS sequence between strains isolated from Chinese olive fruit and related strains

圖5 橄欖果實(shí)6 種潛伏性病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（NJ法）Fig.5 Phylogenetic tree established by the Neighbor-joining method for each of six latent pathogens from Chinese olive fruit

3 討 論

陳瑾[25]和張紹升[26]等從橄欖果實(shí)中分離到多種病原微生物，但未能明確導(dǎo)致采后橄欖果實(shí)腐爛的主導(dǎo)病原真菌種類(lèi)、及其侵入時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)采用組織分離法，在橄欖不同生長(zhǎng)階段的果實(shí)和葉片中，分離出橄欖潛伏病原真菌種類(lèi)、并統(tǒng)計(jì)其分離頻率，進(jìn)一步對(duì)橄欖潛伏病原真菌的致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，明確了橄欖果實(shí)采后貯藏期腐爛敗壞、主要是由于病原真菌的采前潛伏侵染所導(dǎo)致，且明確了主要病原菌種類(lèi)為小新殼梭孢（N.parvum）和小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）。而球座菌屬（Guignardia）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、革菌屬（Phanerochaete）和出芽短梗霉（A.pullulans）等病原菌在橄欖不同生長(zhǎng)階段的分離頻率都處于較低水平，這可能是由于橄欖果實(shí)中存在抗性物質(zhì)、能有效抑制以上分離頻率較低的4 種病原真菌生長(zhǎng)，或者是由于病原菌生長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)作用、導(dǎo)致以上4 種病原真菌不能有效生長(zhǎng)繁殖。

此外，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分離橄欖果實(shí)不同生長(zhǎng)階段葉片的病原真菌種類(lèi)、并統(tǒng)計(jì)其分離頻率，發(fā)現(xiàn)各生長(zhǎng)階段的橄欖葉片主要病原菌種類(lèi)與橄欖果實(shí)的主要潛伏性病原菌種類(lèi)一致。因此認(rèn)為，橄欖果實(shí)和葉片的病原菌之間存在相互侵染的現(xiàn)象。

屬于葡萄座腔菌科（Botryosphaeriacea）的小新殼梭孢（N.parvum）是導(dǎo)致柑橘[27]、草莓[28]、鱷梨[29]、蘋(píng)果[30]、桃[31]、葡萄[32]等果實(shí)腐爛的病原菌，N.parvum侵染果實(shí)初期，在果實(shí)表面會(huì)出現(xiàn)水漬狀凹陷；隨著果實(shí)腐爛的加劇，果實(shí)表面產(chǎn)生大量菌絲，隨后干癟，表面長(zhǎng)出許多黑色分生孢子器。小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）是番石榴果實(shí)的重要致病菌，該病原菌爆發(fā)會(huì)嚴(yán)重影響番石榴果實(shí)品質(zhì)及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[33]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，N.parvum和P.microspora在橄欖盛花期就已經(jīng)潛伏侵染于花器中，而病原菌的活性一直處于較低水平，待橄欖果實(shí)采摘后，因采后橄欖果實(shí)抗性下降，其病原菌活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致采后橄欖果實(shí)病害大量爆發(fā)、果實(shí)腐爛敗壞，嚴(yán)重影響橄欖果實(shí)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

本研究選用橄欖花器、果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其潛伏性病原真菌進(jìn)行分離、鑒定。由于病原菌的生長(zhǎng)繁殖受外界氣候條件影響較大，且同一橄欖品種在同一地區(qū)不同年份、及不同橄欖品種中，其病原菌種類(lèi)及其分離頻率存在一定的差異，具體差異有待于進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)尚未研究橄欖病原菌的侵染來(lái)源及其侵染過(guò)程，因此，需要進(jìn)一步研究橄欖病原菌的來(lái)源及其侵染機(jī)制，將為橄欖果實(shí)采前病害的防治提供理論依據(jù)。

另外，本實(shí)驗(yàn)雖然已鑒定出N.parvum、P.microspora為橄欖果實(shí)最主要的潛伏性病原真菌，但有關(guān)自然狀態(tài)下貯藏，這2 種病害的發(fā)生率值得進(jìn)一步研究；另外，本實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，橄欖潛伏性病原真菌推測(cè)為盛花期侵染，但病原真菌在盛花期侵染后潛伏于何處、最后又如何轉(zhuǎn)移到橄欖果實(shí)上，病原真菌在盛花期侵染如何在橄欖果實(shí)上潛伏至采后貯藏后期，以及橄欖果實(shí)不同部位潛伏侵染菌分布是否存在差異等問(wèn)題值得今后進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

綜合以上分析，發(fā)現(xiàn)小新殼梭孢（N.parvum）、小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、革菌屬（Phanerochaete）、球座菌屬（Guignardia）、出芽短梗霉（A.pullulans）6 種病原真菌是引起采后‘長(zhǎng)營(yíng)’橄欖腐爛的病原菌。其中小新殼梭孢（N.parvum）和小孢擬盤(pán)多毛孢（P.microspora）為‘長(zhǎng)營(yíng)’橄欖果實(shí)最主要的潛伏性病原真菌，在橄欖盛花期即可侵染。上述結(jié)果為制定病原真菌采前侵染橄欖果實(shí)的控制策略提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為控制橄欖果實(shí)采后病害發(fā)生、延長(zhǎng)其保鮮期提供一定科學(xué)依據(jù)和生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)。