王春曉，袁國億，蘇 偉，王 嘯，邱樹毅

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

白酒是以糧谷（高粱、大米、玉米、小麥、糯米等）為主要原料，經(jīng)蒸煮、糖化發(fā)酵（利用特制糖化發(fā)酵劑如大曲、小曲、麩曲、強化曲等中微生物和酶的作用進行，方式有固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)等）生成糖、酸和醇等物質，再經(jīng)蒸餾、陳釀、勾兌制成的中國傳統(tǒng)蒸餾酒[1-2]。白酒中各種不同的物質成分不僅影響其感官品質和質量安全[3-4]，而且與人體健康相關聯(lián)[2]。影響白酒感官品質的風味物質包含酯類、醇類、酸類、醛酮類等，其中酸類物質占風味物質總量的14%～16%[5]，主要包含乙酸、乳酸、己酸和丁酸等[6]，其中乙酸含量最高[7]。白酒中酸類物質主要作為呈味物質調(diào)節(jié)白酒的濃厚感[4-5]，還可作為酯類的前體物質進一步影響白酒的風味形成[8-9]，此外，白酒中報道的138 種健康因子中酸類化合物有16 種[2]。因此，酸類物質的形成與控制是不同白酒釀造中需要關注的重要物質成分指標之一[8]，目前不同香型白酒的國家標準中規(guī)定了總酸的最低含量（如醬香型白酒高度酒優(yōu)級為1.40 g/L，GB/T 26760—2011《醬香型白酒》[10]），但對于上限暫無要求。

研究表明白酒中的酸類物質主要由微生物對糧谷中淀粉的代謝產(chǎn)生[4-5]，由于白酒釀造所用原料、糖化發(fā)酵劑、發(fā)酵及陳釀方式等的不同，不同類型白酒中微生物代謝產(chǎn)生的有機酸具有種類和含量多樣性[7-8,11-12]。白酒中主要的乙酸產(chǎn)生菌為醋酸桿菌屬（Acetobacterium）和葡萄糖桿菌屬（Gluconobacteria）[13]。濃香型白酒中的己酸和丁酸主要由窖泥中的梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）如克氏梭狀桿菌（C.kluyveri）代謝產(chǎn)生[5,14-16]，乳酸由發(fā)酵酒醅中的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（L.plantanrum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、戊糖乳桿菌（L.pentosus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amylociquefaciens）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）和格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）代謝產(chǎn)生[6,17]，乙酸由發(fā)酵酒醅中的巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、東方醋桿菌（A.orientalis）和蘋果醋桿菌（A.malorum）產(chǎn)生[6]。老白干香型白酒中的乳酸主要由大曲和酒醅中的食竇魏斯氏菌（W.cibaria）代謝產(chǎn)生[11]。豉香型白酒中的乙酸和乳酸主要由餅丸和大酒餅中醋酸菌和乳酸菌產(chǎn)生[9]。清香型白酒中的乙酸主要由發(fā)酵酒醅中異常畢赤酵母（Pichia anomala）代謝產(chǎn)生[18]。李兵等[13]研究表明部分根霉能夠產(chǎn)生乳酸，此外，唐玉明等[19]發(fā)現(xiàn)大曲發(fā)酵房中的環(huán)境微生物對曲藥質量的影響主要由酵母菌和細菌產(chǎn)生，酵母菌和細菌與大曲酸度顯著相關。然而，總體而言白酒釀造中對產(chǎn)酸微生物的研究相對較少，五大香型中以濃香型對產(chǎn)酸微生物的研究較多，其余香型較少。且上述白酒對產(chǎn)酸微生物的研究主要集中于曲和酒醅中的醋酸菌和乳酸菌，對酵母菌和霉菌的關注相對較少。目前對白酒中酵母菌的研究主要集中在產(chǎn)酒、產(chǎn)酯和耐酸耐熱等能力，對產(chǎn)酸的研究較少[20]。

因此，本實驗對小曲白酒制曲環(huán)境和成品曲中的產(chǎn)酸微生物進行研究，對成品曲糖化樣品進行主要酸類物質檢測，以考察小曲白酒制曲環(huán)境和曲中的主導產(chǎn)酸微生物。期望對酸的形成和產(chǎn)酸微生物的控制提供理論依據(jù)，并為進一步研究酸對白酒風味的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

成品曲樣品：取自某小曲白酒廠3 個不同曲房，編號為Q1、Q2和Q3。

成品曲糖化樣品：取自某小曲白酒廠，由成品曲Q1、Q2和Q3分別在30 ℃和35 ℃條件下糖化制成，編號為Q1-30、Q1-35、Q2-30、Q2-35、Q3-30和Q3-35，成品曲糖化樣品取樣后置于4 ℃運輸和保存。

制曲環(huán)境空氣微生物樣品：在某兼小曲白酒廠制曲環(huán)境和曲房不同位置進行環(huán)境空氣微生物取樣分析檢測，取樣點共計15 處，6 處位于不同的制曲環(huán)境，9 處位于3 個不同曲房Q1、Q2和Q3的不同位置。取樣時將醋酸菌分離和篩選培養(yǎng)基各3 份敞開置于取樣點10 min，取樣后于30 ℃培養(yǎng)3 d。

1.1.2 培養(yǎng)基

醋酸菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min后冷卻至70 ℃左右加6%（體積分數(shù)）無水乙醇；醋酸菌篩選培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、葡萄糖10 g/L、CaCO310 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min后冷卻至70 ℃左右加6%（體積分數(shù)）無水乙醇；醋酸菌生長液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、酵母膏10 g/L，121 ℃滅菌20 min冷卻至70 ℃左右加3.0%（體積分數(shù)）無水乙醇；YPD培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L。

1.1.3 試劑

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增所用引物和酶等分子試劑 北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；GeneGeen核酸染料 北京天根生化科技有限公司；HyAgarose瓊脂糖 廈門太陽馬生物工程有限公司；三氯化鐵 國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉 天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；α-淀粉酶、糖化酶、瓊脂 北京索萊寶科技有限公司；酵母浸出粉、蛋白胨 上海博微生物科技有限公司；酵母膏 北京奧博星生物科技有限責任公司；碳酸鈣 成都金山化學試劑有限公司；葡萄糖 天津市永大化學試劑有限公司；乳酸、乙酸（均為色譜純），磷酸二氫鉀 天津市科密歐化學試劑有限公司；乙腈（色譜純） 湖北弗頓科學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

JXFSTPRP-24型細胞破碎儀 上海凈信發(fā)展有限公司；MIT-100型恒溫混勻儀 杭州米歐儀器有限公司；X3R型冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；CFX Connect型梯度熒光定量PCR儀、核酸電泳儀 美國Bio-Rad公司；Bio-Bset140E型凝膠成像儀 美國SIM公司；1260高效液相色譜儀（配二極管陣列（G1315D）加蒸發(fā)光） 美國Agilent公司；BX43型電子顯微鏡 日本Olympus公司；SW-CJ-IED型潔凈工作臺、SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-30SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 成品曲糖化樣品中產(chǎn)酸微生物的分離與篩選

1.3.1.1 微生物的分離

取10 g成品曲糖化樣品于裝有30 mL無菌蒸餾水的50 mL離心管中，渦旋均勻后靜置0.5 h，吸取上清液進行10 倍梯度稀釋，將稀釋度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀釋液涂布于醋酸菌分離培養(yǎng)基中，每個稀釋度涂布2 份，30 ℃培養(yǎng)3 d。觀察并記錄不同微生物菌落數(shù)量、菌落形態(tài)和顯微鏡下細胞形態(tài)，初步區(qū)分所分離微生物的類別。

1.3.1.2 產(chǎn)酸微生物的篩選

將1.3.1.1節(jié)中醋酸菌分離培養(yǎng)基分離的不同微生物，點樣培養(yǎng)于醋酸菌篩選培養(yǎng)基，每種類別的菌株重復點樣3 次，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察記錄菌落形態(tài)和碳酸鈣溶解圈大小，挑選具有明顯碳酸鈣溶解圈的菌株進行分離純化及保藏。

1.3.1.3 產(chǎn)酸微生物產(chǎn)乙酸特性分析

取分離自成品曲糖化樣品和制曲環(huán)境空氣微生物樣品中具有明顯碳酸鈣溶解圈的菌株，接種于醋酸菌生長液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)3 d，取10 mL培養(yǎng)液4 000 r/min離心，取5 mL上清液煮沸，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至pH 7.0，滴加50 g/L氯化鐵溶液3～5 滴，觀察是否有紅褐色沉淀產(chǎn)生。

1.3.2 產(chǎn)酸酵母種水平鑒定

將成品曲糖化樣品和制曲環(huán)境空氣微生物樣品中分離篩選的主導產(chǎn)酸酵母，劃線培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基，28～30 ℃培養(yǎng)2 d后采用石英砂破壁法提取DNA[21]，并進一步利用26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析方法鑒定主要產(chǎn)酸酵母[22-23]。PCR擴增引物為NL1和NL4[24]，擴增程序：95 ℃預變性5 min， 94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s（36 個循環(huán)），72 ℃最終延伸8 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物質量，將具有單一條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因測序。測序結果首先通過峰圖質量檢測獲取具有單一峰的堿基序列，然后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，序列相似性大于99%的菌種作為待測菌株的菌種名稱。

1.3.3 成品曲糖化樣品中主要酸類物質含量檢測

利用高效液相色譜法檢測成品曲糖化樣品中主要酸類物質乳酸和乙酸，使用SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長210 nm，流動相為10 mmol/L磷酸二氫鉀-乙腈混合液（體積比99.5∶0.5，pH 2.0），流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。采用混標法建立乳酸和乙酸標準品的標準曲線：乳酸（y=6.847x＋17.82，r2=1）、乙酸（y=8.677x＋32.86，r2=1）。樣品處理：取樣10 g加水20 mL于離心管中超聲處理30 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液加水20 mL離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，采用0.22 μm水系膜過濾。

1.3.4 成品曲糖化樣品酸度測定

取成品曲糖化樣品10 g研細，加200 mL蒸餾水充分攪拌，浸泡0.5 h（每隔10 min攪拌一次），用紗布過濾，吸取濾液20 mL，采用GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[25]指示劑法測定酸度（以乙酸計）。計算公式如下：

式中：c為氫氧化鈉標準滴定溶液的試劑濃度/（mol/L）；V為測定時消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積/mL；100為最終計算樣品的質量/g；60為乙酸的摩爾質量/（g/mol）；10為量取樣品的質量/g；20為吸取樣品的體積/mL；200為量取樣品浸泡后的濾液總體積/mL。

1.3.5 產(chǎn)酸酵母實驗室糖化樣品制備及酸度檢測

產(chǎn)酸酵母實驗室糖化樣品制備過程模擬取樣酒廠制備糖化樣品的過程，不同在于實驗室使用了產(chǎn)酸酵母和糖化酶，而酒廠使用的是成品曲，實驗室糖化樣品的制備主要用于驗證所接種產(chǎn)酸酵母的產(chǎn)酸能力，主要過程如下：取大米50 g，加蒸餾水浸泡過夜，瀝干后，放入250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，121 ℃滅菌20 min，冷卻至30 ℃。A制備方法（直接接種產(chǎn)酸酵母）：選2 株分離自成品曲糖化樣品的產(chǎn)酸酵母FBKL2.8DJCS1和FBKL2.8DJCS2、1 株分離自制曲環(huán)境的產(chǎn)酸酵母FBKL2.8DJCS3，劃線培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后挑取40 個菌落于10 mL無菌蒸餾水中，渦旋后拌勻入大米處理液中，30 ℃培養(yǎng)40 h。B制備方法（大米制備液冷卻后，首先進行糖化處理）：在大米制備液中加入0.945 g淀粉酶和0.28 g糖化酶，封口，放入60 ℃水浴鍋糖化30 min后，冷卻至30 ℃，然后按照A方法接種產(chǎn)酸酵母。A和B兩種糖化樣品制備都設立不接種酵母的對照組。

產(chǎn)酸酵母實驗室糖化樣品制備后，取3 g樣品加入10 mL無菌蒸餾水中，渦旋均勻，取液體通過稀釋涂布法培養(yǎng)于醋酸菌分離培養(yǎng)基，28～30 ℃培養(yǎng)2 d后，觀察驗證A、B和相應對照組中微生物菌落形態(tài)是否與接種產(chǎn)酸酵母一致。產(chǎn)酸酵母實驗室糖化樣品的酸度檢測按1.3.4節(jié)所述方法進行。

1.3.6 成品曲高通量測序分析

成品曲Q1、Q2和Q3送至成都羅寧生物科技有限公司進行DNA提取和高通量測序分析：高通量測序分析目標擴增區(qū)域為16S rRNA基因V3-V4區(qū)，采用帶有Barcode的特異引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[26]，PCR產(chǎn)物電泳、純化和定量后采用試劑盒進行文庫構建和測序，測序平臺為HiSeq 2500測序模式為PE250。

測序獲得的原始序列經(jīng)拼接和過濾后得到高質量目標序列，基于Usearch（http://drive5.com/uparse/）軟件使用UPARSE算法在97%的相似性水平上進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，挑選出OTU的代表性序列（即出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列），使用UCLUST分類法與SILVA數(shù)據(jù)庫（http://www.arb-silva.de/）進行物種分類信息注釋分析，并計算各個分類水平上的豐度信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理和作圖。采用Origin 8.6進行酸度、乳酸和乙酸含量的差異性分析，差異性分析采用單因素方差分析（One Way ANOVA），P＜0.05，差異顯著。均值比較采用Tukey Test方法。

2 結果與分析

2.1 成品曲糖化樣品和制曲環(huán)境空氣微生物樣品中微生物的檢測結果

成品曲糖化樣品中微生物濃度為105～108CFU/mL，其中Q1和Q2成品曲糖化樣品中微生物的濃度明顯高于Q3，為107～108CFU/mL（表1）。Q1、Q2和Q3來自3 個不同曲房，說明曲房環(huán)境可能影響了成品曲糖化樣品中微生物的濃度。不同的糖化溫度也會影響成品曲糖化樣品中微生物的濃度，35 ℃的糖化樣品中微生物濃度高于30 ℃。如表1所示，成品曲糖化樣品中檢測的微生物包含酵母、細菌和霉菌，其中Q1和Q2糖化樣品中只檢測到酵母，且106～108CFU/mL的酵母菌具有產(chǎn)乙酸能力，Q3糖化樣品中檢測到的微生物中只有酵母菌表現(xiàn)出產(chǎn)乙酸能力，說明該小曲白酒廠成品曲糖化樣品中主導產(chǎn)酸菌為酵母菌。

表1 成品曲糖化樣品酸度、主要酸類物質和產(chǎn)酸微生物檢測結果Table 1Acidity, main acids and acid-producing microorganisms in saccharified samples made with mature Qu

成品曲糖化樣品的酸度值在700～1 200 mg/100 g范圍內(nèi)，其中Q1和Q2糖化樣品的酸度平均值高于Q3，與其中產(chǎn)酸酵母的濃度一致，35 ℃制備的糖化樣品酸度平均值低于30 ℃，6 個成品曲糖化樣品的酸度值除Q2-30與Q2-35、Q1-35與Q2-30、Q1-35與Q2-35、Q3-35與Q3-30兩兩之間差異不顯著之外，其余11 組兩兩對比差異性顯著（P＜0.05）。高效液相色譜分析表明成品曲糖化樣品中的主要酸類物質為乳酸和乙酸，其中乳酸含量范圍為30～80 mg/100 g，乙酸含量范圍為4～60 mg/100 g。如表1所示，除Q1-30樣品外，其余糖化樣品中乳酸含量的平均值高于乙酸含量平均值，不同樣品中乳酸含量是乙酸的2～14 倍，35 ℃制備的所有糖化樣品中乙酸含量的平均值低于30 ℃，從而使35 ℃乳酸和乙酸的含量比值明顯高于30 ℃，說明溫度升高酵母菌的產(chǎn)乙酸能力降低。6 個成品曲糖化樣品中的乳酸含量除Q2-30與Q3-30之間差異不顯著之外，其余14 組兩兩對比差異性顯著（P＜0.05）；6 個成品曲糖化樣品中的乙酸含量除Q2-35、Q3-30與Q3-35兩兩之間差異不顯著之外，其余12 組兩兩對比差異性顯著（P＜0.05）。差異性分析結果進一步證實了不同曲中微生物和溫度對糖化樣品的酸度、乳酸和乙酸含量的影響。

制曲環(huán)境和曲房不同位置的空氣微生物檢測結果如表2所示。攪拌器、踩曲處和室外空氣中微生物數(shù)量相對較少（＜30 個），物料房微生物數(shù)量增多，曲房的微生物數(shù)量最多，其中Q1和Q2曲房空氣中微生物數(shù)量高于Q3曲房，3 個曲房都是靠門處微生物數(shù)量最少，Q1和Q3曲房靠窗處微生物數(shù)量高于曲房中間而Q2曲房相反。制曲環(huán)境和曲房不同位置檢測的空氣微生物包含酵母、細菌和霉菌，大部分位置酵母數(shù)量最高，其次為細菌，霉菌最少。每個位置都檢測到產(chǎn)酸菌的存在，產(chǎn)酸菌中包含具有不同菌落特征的酵母和細菌，數(shù)量以曲房最高，物料房其次，其他取樣點最少，主要產(chǎn)酸菌為酵母。

表2 制曲環(huán)境中空氣微生物和產(chǎn)酸微生物數(shù)量Table 2Numbers of total microorganisms and acid-producing microorganisms in Qu-making environment

2.2 主導產(chǎn)乙酸酵母的分離鑒定

圖1 主導產(chǎn)酸酵母菌落形態(tài)、顯微細胞形態(tài)和產(chǎn)乙酸特性Fig.1 Colony morphology, cell characteristics under microscope and acetic acid production of main acid-producing yeast

將生長于醋酸菌分離和篩選培養(yǎng)基上的主導產(chǎn)乙酸酵母進行分離純化和保藏，發(fā)現(xiàn)分離自成品曲糖化樣品和制曲環(huán)境空氣微生物樣品中的主導產(chǎn)乙酸酵母具有類似的菌落特征（圖1a、c）。在醋酸菌分離培養(yǎng)基上菌落呈白色、毛狀、干燥、中央凸起、半徑在2～5 mm左右、邊緣規(guī)則，在醋酸菌篩選培養(yǎng)基上形成明顯的碳酸鈣溶解圈。該主導產(chǎn)乙酸酵母在400×顯微鏡下可觀察到連在一起的菌絲和長在菌絲周圍的卵圓形孢子（圖1b）。選取3 株主導產(chǎn)酸酵母FBKL2.8DJCS1、FBKL2.8DJCS2和FBKL2.8DJCS3進行26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析，這3 株菌的相應序列與模式菌株的序列相似度高于99%，因此鑒定主導產(chǎn)酸酵母為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），該3 株菌在GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列登錄號分別為MN203652、MN203653和MN203654。

將成品曲糖化樣品和制曲環(huán)境空氣微生物樣品中分離的具有明顯碳酸鈣溶解圈的菌株進行產(chǎn)乙酸特性分析，結果發(fā)現(xiàn)大部分菌株能產(chǎn)生磚紅色沉淀（圖1d），即具有產(chǎn)乙酸能力，少部分菌株與沒有透明圈的菌株一樣，無法產(chǎn)生磚紅色沉淀。由于該方法的檢測結果對pH值依賴性較高，穩(wěn)定性相對醋酸菌篩選培養(yǎng)基較低一些，不建議作為醋酸菌篩選的主要方法依據(jù)。

2.3 產(chǎn)酸酵母實驗室糖化樣品的酸度

表3 實驗室產(chǎn)酸酵母糖化樣品的酸度Table 3Acidity of laboratory-prepared saccharified samples inoculated with acid-producing yeast mg/100 g

如表3所示，A和B兩種制備方法都表明接種產(chǎn)酸酵母的糖化樣品酸度值明顯高于不接種微生物的對照組樣品，驗證了所接種酵母在40 h內(nèi)的產(chǎn)酸能力。B制備方法相對于A增加了利用α-淀粉酶和糖化酶進行糖化處理的步驟，該步驟可以提高產(chǎn)酸酵母的產(chǎn)酸能力，因為A方法接種產(chǎn)酸酵母的糖化樣品酸度值高于對照組26.1～52.14 mg/100 g，而B方法中接種產(chǎn)酸酵母的糖化樣品酸度值高于對照組52～60 mg/100 g。糖化處理也明顯增加了對照組的酸度值，主要是由所使用的兩種酶本身酸度引起，這已通過指示劑法檢測兩種酶溶液的酸度值得到驗證。此外，所有實驗室糖化樣品的微生物培養(yǎng)實驗驗證了最終樣品中微生物與所接種酵母的菌落形態(tài)一致，對照組中未檢出微生物?？勰覐湍そ湍冈谝酝难芯繄蟮乐兄饕w現(xiàn)了產(chǎn)淀粉酶、β-糖苷酶和酸性蛋白酶的活性[27-30]，主要貢獻于淀粉的糖化水解過程。本研究首次指出扣囊復膜酵母在糖化過程中的產(chǎn)乙酸能力，為白酒中酸類物質的形成提供了新的思路。

酒廠制備的成品曲糖化樣品酸度值（表1）高于實驗室產(chǎn)酸酵母糖化樣品的酸度值（表3），可能由于成品曲中微生物種類豐富，不僅存在產(chǎn)乙酸的酵母菌，而且存在產(chǎn)乳酸的細菌，此外，成品曲糖化效果可能不同于實驗室酶糖化效果，對產(chǎn)酸的影響也不同。

2.4 成品曲中細菌的高通量測序檢測結果

3 個不同曲房所取成品曲Q1、Q2和Q3的高通量測序結果顯示，有效序列的數(shù)量為29 496、34 277和28 696，序列的平均長度為271～312 bp，檢測到的菌種數(shù)量分別為1 557、1 547和315。α多樣性分析表明，Q1的Chao1指數(shù)略低于Q2，Shannon指數(shù)和InvSimpson指數(shù)略高于Q2，即這兩種成品曲的細菌多樣性類似，Q1的細菌物種豐度略低于Q2，而細菌物種分布均勻性略高于Q2。Q3的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和InvSimpson指數(shù)明顯低于Q1和Q2，表現(xiàn)出了較低的細菌多樣性。

圖2 成品曲Q1、Q2和Q3中的細菌相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria with relative abundance above 1% in mature Qu Q1, Q2 and Q3

如圖2所示，3 種成品曲中相對豐度大于1%的細菌屬為40 種，其中Q1中檢測到13 種、Q2為18 種、Q3為22 種，其中相對豐度大于5%的細菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus，Q3）、擬桿菌科（Bacteroidetes vadinHA17，Q1和Q2）、片球菌屬（Pediococcus，Q2）、Lentimicrobiaceae（Q1和Q2）、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella，Q3）、泛菌屬（Pantoea，Q3）和擬桿菌屬（Bacteroides，Q3）。3 種成品曲中都檢測到一定比例的乳酸菌，主要包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬，如圖2所示，Q3中乳酸菌含量最高，包含17.92%乳桿菌屬、2.38%魏斯氏菌和0.76%片球菌屬，其次為Q2包含2.69%乳桿菌屬、0.60%魏斯氏菌和5.01%片球菌屬，Q1中乳酸菌含量最低，包含0.44%乳桿菌屬、0.09%魏斯氏菌和0.81%片球菌屬。3 種成品曲中檢測到的乳桿菌屬包含6 個主導菌種：香腸乳桿菌（L.farciminis）、唾液乳桿菌（L.salivarius）、植物乳桿菌（L.plantarum）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、短乳桿菌（L.brevis）和約氏乳桿菌（L.johnsonii），檢測到的魏斯氏菌主要為食竇魏斯氏菌（W.cibaria），檢測到的片球菌主要為戊糖片球菌（P.pentosaceus）。此外，只在Q2中檢測到少量醋酸桿菌屬（Acetobacterium，0.02%）細菌，Q1和Q3中未檢測到醋酸菌存在。

3 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)小曲白酒成品曲糖化樣品中主要的酸類物質為乳酸和乙酸，且乳酸含量大多高于乙酸。高通量測序檢測到成品曲中主要的乳酸產(chǎn)生菌為香腸乳桿菌、唾液乳桿菌、植物乳桿菌、卷曲乳桿菌、短乳桿菌、約氏乳桿菌、食竇魏斯氏菌和戊糖片球菌。通過分離篩選實驗發(fā)現(xiàn)制曲環(huán)境和成品曲糖化樣品中主要的乙酸產(chǎn)生菌為扣囊復膜酵母，該酵母在實驗室純種糖化樣品制備中體現(xiàn)了其產(chǎn)酸能力。本研究在成品曲、成品曲糖化樣品和制曲環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)醋酸菌的大量存在，首次報道了扣囊復膜酵母在乙酸形成中的作用，為利用扣囊覆膜酵母發(fā)酵產(chǎn)酸提供了一定的理論依據(jù)。