劉冰冰，周開心，葉麗靖，余盈盈，李學(xué)思，閆培勛，郭書賢,

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004；2.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

濃香型白酒的發(fā)酵是酒曲、窖泥及酒醅之間微生物以酒醅為載體發(fā)生復(fù)雜生化反應(yīng)的過程，這一期間不同微生物之間相互作用，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生有序變化[1]。濃香型白酒的香味物質(zhì)主要來(lái)自酒醅中微生物發(fā)酵，其中丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯是濃香型白酒中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的主要香味物質(zhì)，另外還包括其他醇酸類等[2]。

一般把能夠產(chǎn)生香味或能夠產(chǎn)生產(chǎn)香物質(zhì)前體的微生物統(tǒng)稱為產(chǎn)香菌。產(chǎn)香菌包括香氣及其前體物產(chǎn)生菌[3-6]（如己酸菌、醋酸菌、乳酸菌、丙酸菌、丁酸菌、芽孢桿菌、硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌、鏈霉菌等）及酯化酶產(chǎn)生菌（如釀酒酵母菌、漢遜酵母菌、假絲酵母屬、酒香酵母屬、球似酵母菌屬等[7-8]；曲霉、根霉等[9]）。對(duì)產(chǎn)香微生物進(jìn)行分離及鑒定，有助于進(jìn)一步研究白酒發(fā)酵過程中微生物的功能，同時(shí)也能夠進(jìn)一步指導(dǎo)實(shí)踐生產(chǎn)。利用產(chǎn)香微生物制作成己酸菌液、酯化酵母液、生香窖泥等效果顯著[10-12]。決定濃香型白酒品質(zhì)的主要風(fēng)味物質(zhì)是己酸乙酯，通過對(duì)產(chǎn)香微生物的研究，提出“增己降乳”的指導(dǎo)思路，對(duì)于提升白酒品質(zhì)及競(jìng)爭(zhēng)力具有重要的理論價(jià)值[13-14]。酒醅是白酒的主要產(chǎn)生體，對(duì)于宋河鎮(zhèn)濃香型白酒，酒醅的發(fā)酵時(shí)間歷經(jīng)60 d。宋河鎮(zhèn)濃香型白酒豐滿醇厚的口感與酒醅中微生物有重要的關(guān)系。本研究以宋河鎮(zhèn)濃香型白酒不同時(shí)期酒醅作為研究對(duì)象，探尋其中的產(chǎn)香微生物類群，研究產(chǎn)香微生物的生理生化特性，以期為進(jìn)一步挖掘與利用宋河鎮(zhèn)濃香型白酒酒醅產(chǎn)香微生物的代謝特征提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

表1 酒醅樣品信息Table 1 Information about samples of fermented grains tested in this study

2018年3 月于河南省鹿邑縣宋河鎮(zhèn)宋河酒業(yè)股份有限公司濃香型酒窖中取酒醅樣本。按照酒醅發(fā)酵周期，取發(fā)酵0 d窖池中間酒醅樣品，發(fā)酵3、15、27、48、60 d窖池中間酒醅及貼壁酒醅上、中、下3 個(gè)位置的樣品；窖池中間、窖池壁的上中下位置樣品分別混合，總計(jì)合并為11 個(gè)樣品，裝于無(wú)菌采樣瓶中，4 ℃保藏。樣品信息如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基種類與組成

1.1.2.1 菌株分離培養(yǎng)基

高氏培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，添加制霉菌素（50 μg/L）以抑制真菌的生長(zhǎng)。

1.1.2.2 菌株形態(tài)鑒定培養(yǎng)基

R2A培養(yǎng)基：酵母浸出粉0.5 g，蛋白胨0.5 g，酪蛋白水解物0.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀0.5 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.024 g，丙酮酸鈉0.3 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

CDA培養(yǎng)基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP4培養(yǎng)基：可溶淀粉性10 g，K2HPO42 g，CaCO34 g，微量鹽2 mL，(NH4)2SO44 g，MgSO4·7H2O 2 g，NaCl 2 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP3培養(yǎng)基：燕麥片20 g＋1 L水煮沸20 min，粗紗布過濾補(bǔ)水到1 L，微量鹽1 mL，瓊脂20 g，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP5培養(yǎng)基：L-天門冬酰胺1 g，甘油10 g，K2HPO41 g，微量鹽1 mL，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

ISP2培養(yǎng)基：酵母膏4 g，麥芽膏10 g，葡萄糖4 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

微量鹽培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水100 mL，pH值自然。

選用標(biāo)準(zhǔn)為菌株最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基及放線菌形態(tài)特征描述國(guó)際公認(rèn)培養(yǎng)基。

1.1.2.3 生理生化檢測(cè)及酶活性篩選培養(yǎng)基

溫度生長(zhǎng)范圍、抗生素敏感、乙醇耐受實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基選自1.1.2.2節(jié)最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

碳源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.64 g，KH2PO42.38 g，K2HPO45.65 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，微量鹽1 mL，蛋白胨0.125 g，胰蛋白胨0.25 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

酶活性檢測(cè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g，葡萄糖0.5 g，KCl 0.5 g，硝酸鉀1 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH值自然。

淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、酯分解酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基分別以酶活性檢測(cè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為母液，分別添加0.5%的可溶性淀粉、羥甲基纖維素鈉（0.2%）、果膠、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80，pH 7.2。

酯化酶檢測(cè)培養(yǎng)基[15]：聚乙烯醇乳化液100 mL，酶活性檢測(cè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 000 mL，pH值自然。聚乙烯醇乳化液：30 mL 3%聚乙烯醇，10 mL甘油三丁酸酯，放于冰箱5～10 ℃靜置1～2 h，超聲波破碎儀120 W處理60 min，溶液由分層變成均勻乳白色，且不再分層。乳化液經(jīng)過濾器過濾除菌，按照每100 mL培養(yǎng)基加入1 mL乳化液倒平板（聚乙烯醇乳化液現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.2 儀器與設(shè)備

LD2X-50KBS立式高溫滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；FA1004電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SWCJ-ZG單人凈化工作臺(tái) 蘇中凈化公司；BPS-150生化培養(yǎng)箱 上海訊博實(shí)驗(yàn)儀器公司；HZQ-B數(shù)顯恒溫?fù)u床蘇威爾試驗(yàn)儀器公司；AX10相差顯微鏡 德國(guó)蔡司公司；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)默克公司；SB-800DT超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技有限公司；SMART-N水純化系統(tǒng) 立康生物醫(yī)療控股有限公司；HYC-390醫(yī)用冷藏冰箱 海爾醫(yī)療電器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株純培養(yǎng)分離及純化

將酒醅樣品無(wú)菌條件下自然風(fēng)干，采用梯度稀釋方法稀釋濃度為10-3。取100 μL菌懸液涂布于分離平板上，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌種生長(zhǎng)情況及形態(tài)。挑取不同形態(tài)微生物于R2A培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接2 代，37 ℃培養(yǎng)3 d以獲得形態(tài)單一的純菌株。超凈工作臺(tái)中，打開培養(yǎng)皿蓋一端，通過30 名學(xué)生的感官評(píng)判，判斷菌株是否產(chǎn)生香味。對(duì)產(chǎn)香菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)接擴(kuò)繁，保藏甘油管。

1.3.2 菌株形態(tài)觀察

接種菌株于R2A、CDA、ISP4、ISP5、ISP3、ISP2的斜面中，37 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌株的菌體顏色、形態(tài)、產(chǎn)孢及產(chǎn)色素情況[16]。接種菌株于R2A液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)3～4 d，4 000 r/min離心收集菌體，用生理鹽水沖洗菌體2～3 次，以洗去培養(yǎng)基成分，最終制成生理鹽水菌懸液，于40 倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征。革蘭氏反應(yīng)檢測(cè)選用KOH方法[17]。

1.3.3 菌株16S rRNA基因克隆鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用Power soil試劑盒提取產(chǎn)香菌株基因組，選用16S rRNA基因引物[18]（27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：2×TaqPCR StarMix（康潤(rùn)生物）10 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去離子水7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)32 次；72 ℃延伸10 min。送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因克隆測(cè)序。16S rRNA基因序列通過EZBioCloud[19]進(jìn)行比對(duì)，分析菌株16S rRNA基因相似性，初步確定菌株分類地位。下載相似菌株16S rRNA基因序列，選用CLUSTAL-X軟件[20]進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA 5[21]構(gòu)建菌株16S rRNA基因NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]。

1.3.4 生理生化指標(biāo)鑒定

1.3.4.1 不同溫度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

將菌株接種于R2A固體培養(yǎng)基上，分別置于25、30、37、42、45、50 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察其生長(zhǎng)情況，界定菌株的溫度生長(zhǎng)范圍及最適生長(zhǎng)溫度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3.4.2 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)

采用0.85%生理鹽水制作菌株菌懸液，涂布于R2A固體培養(yǎng)基上。采用紙片法[23]，選用制菌霉素（100 μg/片）、多黏菌素（300 IU/片）、慶大霉素（10 μg/片）、利福平（5 μg/片）、新生霉素（30 μg/片）、桿菌肽（0.04 U/片）、新霉素 （30 μg/片）、紅霉素（15 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、氨芐西林（10 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、萬(wàn)古霉素（30 μg/片）、四環(huán)霉素（30 μg/片）等抗生素紙片點(diǎn)植于涂布菌體的R2A固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌株對(duì)抗生素的耐受特征。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，取2 個(gè)及以上一致的結(jié)果記錄為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.4.3 酶活性檢測(cè)

采用點(diǎn)植法，分別接種菌株于淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶活性檢測(cè)平板中，37 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落周邊透明圈有無(wú)及大小，判斷產(chǎn)蛋白酶、酯化酶特性；采用碘液染色，觀察菌株周邊透明圈有無(wú)及大小判斷產(chǎn)淀粉酶特性；采用0.2%的剛果紅染色30 min，隨后用2%的NaCl溶液浸泡沖洗至洗脫液為無(wú)色，觀察菌株周邊透明圈有無(wú)及大小，判斷產(chǎn)纖維素酶特性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，取2 個(gè)及以上一致的結(jié)果記錄為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.4.4 不同pH值條件下酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

1.3.4.5 API試劑條檢測(cè)

分別選用API ZYM[26]、API 50CH、API 20NE試劑條（bioMérieux）對(duì)菌株的酶學(xué)特性、碳源產(chǎn)酸、碳源利用等生理生化特性進(jìn)行檢測(cè)。恒溫箱37 ℃培養(yǎng)，按照API操作手冊(cè)進(jìn)行結(jié)果觀察并記錄。

1.3.4.6 乙醇耐受檢測(cè)

在酒醅發(fā)酵過程中微生物會(huì)持續(xù)產(chǎn)生乙醇，一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)分離到的菌株分離自酒醅中，且在酒醅發(fā)酵前期3 d及發(fā)酵中期27 d均分離得到，說明該菌株能夠耐受一定量的乙醇。配制不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0%、2%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%）的R2A液體培養(yǎng)基于帶有內(nèi)塞的5 mL螺口厭氧瓶中，115 ℃滅菌20 min，加入200 μL菌懸液（OD600nm≈1.0），37 ℃、140 r/min倒置搖床培養(yǎng)4～6 d，測(cè)定OD600nm值判斷乙醇耐受范圍。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，取3 個(gè)平均值記錄為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.3.5 有氧及無(wú)氧條件下菌株G培養(yǎng)基發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)及分析

采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[27]檢測(cè)發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)成分。取發(fā)酵液6 mL裝入20 mL頂空瓶中密封好，45 ℃條件下對(duì)樣品瓶振蕩加熱45 min，在100 ℃條件下對(duì)儀器閥和定量環(huán)進(jìn)行加熱，傳輸線溫度設(shè)定110 ℃。樣品進(jìn)樣體積1 mL，進(jìn)樣時(shí)間1 min。氣相色譜-質(zhì)譜分析儀進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣為氦氣，流速1.2 mL/min，分流比5∶1。柱箱升溫程序：初始溫度50 ℃，維持2 min；以3 ℃/min速率升溫至80 ℃，維持2 min；以3 ℃/min速率升溫至230 ℃，維持10 min。質(zhì)譜條件：使用電子電離源，設(shè)定離子源溫度230 ℃，四極桿溫度170 ℃，輔助加熱溫度250 ℃；電子能量70 eV，燈絲流量0.20 mA，檢測(cè)器電壓350 V。采用全掃模式收集信號(hào)，掃描范圍m/z33～550。測(cè)定結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫(kù)NIST14.L進(jìn)行定性分析，面積歸一化法進(jìn)行定量分析，通過匹配度及CAS號(hào)判斷可能的物質(zhì)種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離情況

純化得到1 株放線菌形態(tài)的微生物，R2A固體培養(yǎng)基上呈黃色、不產(chǎn)孢、質(zhì)地堅(jiān)硬、有基絲、表面有少許黏液狀分泌物，嗅覺感官評(píng)判具有一定香味，記錄菌號(hào)為12。對(duì)比不同培養(yǎng)基的形態(tài)特征，分析純培養(yǎng)結(jié)果可知，在酒醅發(fā)酵3、15、27 d的樣點(diǎn)中均分離到該菌株，且靠近酒池壁樣品P3-B分離較多，共得到6 株；15 d酒池中間樣品P15-Z分離到2 株；27 d酒池中間樣品P27-Z分離到1 株。在0、48、60 d酒醅樣品中均未分離得到。

老巴說：“我曉得。剛才四強(qiáng)來(lái)借輪椅，我叫他晚上來(lái)拿。擱在墻角，蠻久沒有用，灰大。你拿出來(lái)，抹一抹給他?！?/p>

2.2 菌株形態(tài)

2.2.1 12 號(hào)菌株在不同培養(yǎng)基斜面的生長(zhǎng)情況

如表2所示，在CDA、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、R2A上均有不同程度的生長(zhǎng)，以R2A培養(yǎng)基生長(zhǎng)最優(yōu)，菌體為黃色，有基內(nèi)菌絲，不分泌色素，無(wú)氣生菌絲。

表2 12號(hào)菌株斜面生長(zhǎng)情況Table 2 Growth conditions of strain 12

2.2.2 12 號(hào)菌株平板及光學(xué)顯微鏡形態(tài)特征

12號(hào)菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌株，在R2A固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d的平板及光學(xué)顯微鏡形態(tài)如圖1、2所示。菌落為黃色，無(wú)孢子，表面有分泌物，有基絲，難以挑取。40 倍光學(xué)顯微鏡顯示，菌株呈不規(guī)則球狀，且分泌有大量顆粒狀胞外物質(zhì)。

圖1 12號(hào)菌株的平板菌落形態(tài)Fig.1 Plate colony morphology of strain 12

圖2 12號(hào)菌株的相差顯微鏡形態(tài)Fig.2 Phase contrast microscope image of the morphology of strain 12

2.3 12號(hào)菌株16S rRNA基因分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rRNA基因比對(duì)結(jié)果表明：12號(hào)菌株與Cellulosimicrobium cellulans最為相似，相似度為99.72%，其次為C.aquatile（99.65%）、C.funkei（99.65%）、C.marinum（98.89%），初步判斷12號(hào)菌株的分類地位為：細(xì)菌（Bacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）、微球菌目（Micrococcales）、原小單孢菌科（Promicromonosporaceae）、纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）。

圖3 12號(hào)菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹Fig.3 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on nearly complete 16S rRNA gene sequence of strain 12

如圖3所示，12號(hào)菌株與C.cellulans、C.aquatile共聚在一個(gè)分支上，說明在進(jìn)化關(guān)系上與這兩株菌較相近；3 株菌的共同分支與C.marinum、C.funkei分別位于不同的分支，5 株菌共同組成一個(gè)大的分支，綜合16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果，判斷12號(hào)菌屬于纖維微菌屬（Cellulosimicrobium）。Schumann等[28]首次描述了纖維微菌屬，目前為止，該屬包括5 個(gè)生效發(fā)表種[29]：C.cellulans（2001）[28]、C.funkei（2006）[30]、C.terreum（2007）[31]、C.marinum（2016）[32]、C.aquatile（2015）[33]。該屬的一個(gè)重要特征是具有纖維素分解活性。目前報(bào)道已經(jīng)從臨床樣本[30]、土壤[31]、海底沉積物[32]、水庫(kù)[33]、海洋海綿[34]、南極洲冰雪[35]等環(huán)境中分離到該類群。本次實(shí)驗(yàn)首次從宋河鎮(zhèn)濃香型白酒酒醅中分離到纖維微菌屬的菌株。

2.4 生理生化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 溫度耐受實(shí)驗(yàn)

表3 12號(hào)菌株的溫度生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of strain 12 at different temperatures

如表3所示，12號(hào)菌株的生長(zhǎng)范圍為15～50 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃。在20、25 ℃條件下生長(zhǎng)較30 ℃與37 ℃時(shí)慢，感官判斷香味較淡；在30～37 ℃生長(zhǎng)趨勢(shì)最好，感官判斷香味較濃；42 ℃時(shí)生長(zhǎng)開始減弱，45 ℃時(shí)生長(zhǎng)受到高溫抑制，50 ℃幾乎不長(zhǎng)。

2.4.2 抗生素實(shí)驗(yàn)

圖4顯示，卡那霉素、四環(huán)素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、利福平、多黏菌素、氯霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素這10 種抗生素對(duì)菌株具有明顯抑制作用；諾氟沙星、氨芐西林、制霉菌素、桿菌肽這4 種抗生素對(duì)菌株沒有抑制作用。

圖4 12號(hào)菌株的抗生素實(shí)驗(yàn)Fig.4 Inhibitory effect of antibiotics on strain12

2.4.3 菌株酶活性特征

12號(hào)菌株在pH 7.0固體培養(yǎng)條件下，蛋白酶、氧化酶、過氧化氫酶為陽(yáng)性；淀粉酶、纖維素酶、酯化酶均為陰性。不同的培養(yǎng)條件有可能會(huì)導(dǎo)致菌株的酶活性質(zhì)發(fā)生變化，結(jié)合菌株的分離環(huán)境，選用液體條件下，以羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、濾紙、淀粉、脫脂牛奶、三丁酸甘油酯，在不同的pH值條件下，測(cè)定其生長(zhǎng)情況及相關(guān)酶活性性質(zhì)。

圖5 12號(hào)菌株不同底物、不同pH值液體條件下生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth conditions of strain 12 in liquid medium with different substrates and at different pH values

如圖5所示，以羧甲基纖維素鈉為底物，4 d之后在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)有明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象；以微晶纖維素為底物，4 d之后在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)有明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象；以濾紙為底物，4 d之后在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)有明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象。采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖結(jié)果表明，在以羧甲基纖維素鈉為底物條件下，pH 5.5～6.0范圍內(nèi)還原糖檢測(cè)反應(yīng)為陽(yáng)性；在以微晶纖維素為底物條件下，pH 5.0～6.5范圍內(nèi)還原糖檢測(cè)反應(yīng)為陽(yáng)性；在以濾紙為底物條件下，pH 5.5～6.0范圍內(nèi)還原糖檢測(cè)反應(yīng)為陽(yáng)性；3 種底物條件下能夠在液體酸性條件下檢測(cè)到菌株具有纖維素酶活性。菌株在以淀粉為底物的培養(yǎng)基中，1 d之后即有明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象，pH 5.0～8.0之間均具有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì)，且各自表現(xiàn)出不同顏色，說明不同pH值條件下菌株以淀粉為底物發(fā)酵產(chǎn)物可能具有一定差異。牛津杯法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pH 5.0～7.5的發(fā)酵液有淀粉酶活性。菌株在以脫脂牛奶為底物的培養(yǎng)基中，2 d能明顯觀察到生長(zhǎng)現(xiàn)象，pH 5.0～10.0生長(zhǎng)明顯，牛津杯法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pH 5.5～9.5的發(fā)酵液有蛋白酶活性。菌株在以三丁酸甘油酯為底物的培養(yǎng)基中，幾乎觀察不到生長(zhǎng)現(xiàn)象，發(fā)酵7 d之后，牛津杯法檢測(cè)不同pH值發(fā)酵液無(wú)酯酶活性。結(jié)合后續(xù)菌株API ZYM實(shí)驗(yàn)中，類脂酶（C14）活性為陰性，酯酶（C4）及類脂酯酶（C8）活性為陽(yáng)性，有可能該菌株只能合成或分解較短的脂肪酸鏈，不能合成或分解較長(zhǎng)的脂肪酸鏈。

2.4.4 12 號(hào)菌株API系統(tǒng)鑒定

2.4.4.1 12號(hào)菌株API 20NE檢測(cè)結(jié)果

API 20NE結(jié)果表明，12號(hào)菌的硝酸鹽還原、葡萄糖酸化、精氨酸雙水解酶、脲酶、葡萄糖苷酶、明膠蛋白酶、半乳糖苷酶反應(yīng)為陽(yáng)性，色氨酸水解呈陰性，吲哚產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)為陰性。碳水化合物同化實(shí)驗(yàn)中對(duì)硝基-D-甲基半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖鹽酸同化實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，甘露醇、葵酸、己二酸、檸檬酸、苯乙酸同化實(shí)驗(yàn)為陰性。

2.4.4.2 12號(hào)菌株API 50CH檢測(cè)結(jié)果

API 50CH結(jié)果顯示，12號(hào)菌株能利用甘油、L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺、七葉靈、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、肝糖、龍膽二糖、D-松二糖、D-米蘇糖作為碳源生長(zhǎng)且產(chǎn)酸。不能利用以下碳源產(chǎn)酸：赤蘚醇、D-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、L-木糖、阿東醇、β-甲基-D-木糖苷、山梨糖、鼠李糖、衛(wèi)茅醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、苦杏仁苷、熊果苷、柳醇、乳糖、蜜二糖、菊糖、松叁糖、棉子糖、木糖醇、D-塔格糖、D-巖糖、L-巖糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鹽、2-酮基-葡萄糖酸鹽、5-酮基-葡萄糖酸鹽。結(jié)合菌株特殊的分離生境，菌株的產(chǎn)酸特性在酒醅發(fā)酵過程中可能具有重要的作用。具體產(chǎn)生何種酸及相關(guān)副產(chǎn)物有待于進(jìn)一步分析。

2.4.4.3 12號(hào)菌株API ZYM檢測(cè)結(jié)果

API ZYM結(jié)果顯示，12號(hào)菌株的堿性磷酸鹽酶、酯酶（C4）、類脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖苷酶反應(yīng)為陽(yáng)性。類脂酶（C14）、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-巖藻糖苷酶反應(yīng)為陰性。

2.4.5 12 號(hào)菌株乙醇耐受實(shí)驗(yàn)

表4 12號(hào)菌株乙醇耐受實(shí)驗(yàn)OD600 nm值Table 4 OD600 nm values from tolerance of strain 12 to ethanol at different concentrations

選用剛加入菌液未發(fā)酵作為對(duì)照，測(cè)定其OD600nm為0.046。分析可知12號(hào)菌在0%～9%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下均具有一定的生長(zhǎng)現(xiàn)象，但是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，菌株生長(zhǎng)受到一定抑制（表4）。說明較高濃度的乙醇對(duì)菌株具有抑制作用，這也能夠說明為何在48、60 d酒醅樣品中并未分離到該菌株，而在3、15、27 d的酒醅樣品中能夠分離到該菌株。

2.5 菌株發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)分析

表5 12號(hào)菌株在有氧條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table 5 Analysis of volatile substances produced by strain 12 under anaerobic conditions

表6 12號(hào)菌株在厭氧（低氧）條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Table 6 Analysis of volatile substances produced by strain 12 under aerobic conditions

白酒發(fā)酵過程既包含有氧也包含低氧條件，結(jié)合菌株在高氏培養(yǎng)基上能夠聞到香味的特性，選用G培養(yǎng)基模擬在有氧及低氧條件下進(jìn)行發(fā)酵，檢測(cè)其中的揮發(fā)性物質(zhì)。表5、6表明，在有氧條件下，淀粉為底物發(fā)酵液中檢測(cè)到甲硫醇（匹配度58）、酸草醯脲（匹配度42）、2,2,4-三甲基-3-羧基異丁基戊酸酯（匹配度46），由于匹配度都較低，且對(duì)應(yīng)結(jié)果的峰值過低，有可能是在發(fā)酵過程中大部分的揮發(fā)性物質(zhì)已經(jīng)散發(fā)，所以檢測(cè)不到相關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)。采用厭氧瓶密封發(fā)酵2 d，以淀粉為底物，檢測(cè)到發(fā)酵液中可能含有乙醇（匹配度64）、醋酸（匹配度90）、1,2,2-三氯-1,1-二氟乙烷（匹配度47）、2-十五烷基丁酸酯（匹配度30）。相比較而言，菌株在低氧條件下主要是產(chǎn)酸及產(chǎn)乙醇，另外也有少量復(fù)雜化合物產(chǎn)生，在有氧條件下會(huì)更多地生成更為復(fù)雜的化合物，但是由于含量少或者是數(shù)據(jù)庫(kù)未匹配到，所以目前未知其確切成分，有待于進(jìn)一步分析。

3 結(jié) 論

12號(hào)菌株是分離自宋河鎮(zhèn)濃香型白酒酒醅中的1 株產(chǎn)香放線菌，在酒醅發(fā)酵3、15、27 d的樣點(diǎn)中均能分離得到，且在3 d樣點(diǎn)中分離到的數(shù)目較多。12號(hào)菌株判斷為纖維纖維微菌的一個(gè)菌株，首次在酒醅樣品中分離得到，在R2A斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最適合，其次是ISP3和ISP4。最佳生長(zhǎng)溫度為30～37 ℃，生長(zhǎng)溫度范圍為15～50 ℃，乙醇耐受范圍為0%～9%。菌株對(duì)諾氟沙星、氨芐西林、制霉菌素、桿菌肽不敏感，對(duì)卡那霉素、四環(huán)素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、利福平、多黏菌素、氯霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素等抗生素敏感。菌株在酸性或中性偏酸性液體條件下生長(zhǎng)情況較好。菌株在液體條件下具有纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶活性，在酸性條件下能夠檢測(cè)到以羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、濾紙為底物纖維素酶活性；淀粉酶的活性主要是酸性條件下能夠檢測(cè)得到；蛋白酶的活性在酸性、中性及堿性條件下都能夠檢測(cè)得到；以三丁酸甘油酯為底物的酯酶活性在固體及液體條件下（pH 4.0～10.0）均未檢測(cè)到。

微生物代謝參與了白酒發(fā)酵過程中復(fù)雜風(fēng)味物質(zhì)的形成，尤其是產(chǎn)香微生物，能夠代謝產(chǎn)生香味物質(zhì)或是香味物質(zhì)的前體物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)從宋河鎮(zhèn)濃香型白酒酒醅樣品中分離到12號(hào)菌株，通過感官評(píng)判，發(fā)現(xiàn)菌株能夠產(chǎn)生一定的香味，通過進(jìn)一步對(duì)菌株好氧及厭氧（低氧）條件下的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菌株在低氧條件下能夠產(chǎn)生乙酸乙酯的前體物質(zhì)乙醇、乙酸。結(jié)合API ZYM酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株具有酯酶（C4）、類脂酯酶（C8）活性，無(wú)類脂酶（C14）活性；同時(shí)在以三丁酸甘油酯（C15）為底物的固體及液體條件下均未檢測(cè)到酯酶活性，從而判斷菌株可能合成或分解較短碳鏈的脂肪酸鏈，不能合成或分解較長(zhǎng)的脂肪酸鏈。在后續(xù)的研究中，可以選擇不同的碳源，添加適量氮源及延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間檢測(cè)菌株的揮發(fā)性物質(zhì)。同時(shí)可以對(duì)該菌株進(jìn)行特定引物設(shè)計(jì)，利用免培養(yǎng)的手段從宋河鎮(zhèn)濃香型白酒窖泥、酒醅、酒曲、環(huán)境等取樣測(cè)定，探究菌株的來(lái)源。