趙 蘭，劉詩(shī)夢(mèng)，秦漢雄，王亞南，樊占青，閔偉紅

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

甲硫氨酸是生命體不可缺少的唯一含硫必需氨基酸，作為多種重要代謝物質(zhì)的合成前體，參與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)甲基和轉(zhuǎn)硫基過程，對(duì)生物體新陳代謝起重要作用[1]。由于動(dòng)物體內(nèi)無法自身合成，必須從外部食物中獲取，因此被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，需求量巨大且附加值較高[2]。目前，甲硫氨酸的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法，該方法存在污染大、耗能高且產(chǎn)物不易分離等諸多不利因素[3]，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者及生產(chǎn)者不斷尋求環(huán)境友好的微生物發(fā)酵法替代此方法生產(chǎn)。

但目前微生物發(fā)酵法難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其主要原因?yàn)槲⑸矬w內(nèi)合成的代謝系統(tǒng)較為復(fù)雜，受到嚴(yán)格的調(diào)控作用，使得碳流競(jìng)爭(zhēng)激烈無法為甲硫氨酸提供足夠碳骨架[4-5]。甲硫氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，受到副產(chǎn)物賴氨酸及蘇氨酸嚴(yán)格反饋抑制及反饋?zhàn)瓒?，影響了甲硫氨酸的合成[6]。需要改造具有解除末端氨基酸抑制作用的高酶活性突變菌，促使更多的碳流量進(jìn)入甲硫氨酸合成途徑。研究學(xué)者已相繼解析了合成途徑關(guān)鍵酶天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）及高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSD）的晶體結(jié)構(gòu)、抑制方式、調(diào)節(jié)機(jī)制和效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)，為改造氨基酸生產(chǎn)菌株提供新的參考[7-11]。其次蘇氨酸及賴氨酸支路對(duì)碳流量競(jìng)爭(zhēng)激烈，影響了甲硫氨酸的合成。合成過程中，因碳流存在優(yōu)先合成天冬氨酸半醛的調(diào)控機(jī)制使得蘇氨酸與甲硫氨酸競(jìng)爭(zhēng)更為激烈[12]，又因單一敲除蘇氨酸支路會(huì)導(dǎo)致菌株代謝不平衡，難以正常生長(zhǎng)[13]，因此可考慮采用系統(tǒng)代謝工程[14]獲得弱化蘇氨酸支路的生產(chǎn)菌株。使所合成蘇基酸量?jī)H供應(yīng)菌株生長(zhǎng)，同時(shí)解除其對(duì)AK及HSD的抑制作用，最終提高產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)室以抗結(jié)構(gòu)類似物北京棒桿菌（Corynebacterium pekinense）E31為基礎(chǔ)，對(duì)天冬氨酸族氨基酸代謝途徑的關(guān)鍵酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了單體酶AK，篩選出影響AK及HSD活性的多個(gè)關(guān)鍵殘基位點(diǎn)，構(gòu)建了多株高酶活性且解除反饋抑制作用的菌株[15-17]。

谷氨酸棒桿菌具有代謝調(diào)控系統(tǒng)簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰且無致病性等優(yōu)點(diǎn)，常被用來生產(chǎn)天冬氨酸家族氨基酸[18-21]。本研究對(duì)谷氨酸棒桿菌代謝途徑進(jìn)行改造，通過不同遺傳操作手段逐步探究合成途徑阻遏關(guān)鍵位點(diǎn)。在對(duì)合成途徑關(guān)鍵酶AK、HSD及高絲氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶（homoserine acetyltransferase，HAT）[22]進(jìn)行改造的基礎(chǔ)上構(gòu)建串聯(lián)過表達(dá)載體，以增強(qiáng)各關(guān)鍵酶的表達(dá)量，最終通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）、高效液相色譜分析基因表達(dá)情況及氨基酸變化情況，探究碳流阻遏點(diǎn)。并對(duì)蘇氨酸支路thrB的底物高絲氨酸結(jié)合位點(diǎn)A20進(jìn)行酸性、堿性、極性和非極性4 種類型8 種不同氨基酸定點(diǎn)突變研究，篩選相比于原菌酶活性降低的突變體。以期為規(guī)?；⑸锇l(fā)酵法生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

谷氨酸棒桿菌ATCC13032、北京棒桿菌AS1.299、天冬氨酸重組載體（PET28a-lysC）及HSD重組質(zhì)粒（PMD18T-hom）、克隆宿主大腸桿菌DH5α和表達(dá)宿主大腸桿菌BL21（DE3）均由實(shí)驗(yàn)室提供；穿梭表達(dá)載體PECXK99E 湖南豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、ExTaq?Prime STAR?HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、pMD?18-T Vector Cloning Kit、DpnI消化酶 TaRaKa（大連）有限公司；ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 諾唯贊生物科技有限公司；BamHI、EcoRI、HindIII、salI、sacI等限制性核酸內(nèi)切酶 莫納（蘇州）生物科技有限公司；DiaSpin Plasmid Mini-Preps Kit、DiaSpin DNA Gel Extraction Kit生工生物工程（上海）股份有限公司；real-time PCR相關(guān)試劑盒TransGen Biotech試劑公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐霉素、卡那霉素 北京鼎國(guó)生物公司；SB C18柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm） 安捷倫科技（中國(guó)）有限公司。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L（固體培養(yǎng)基另外添加20 g/L瓊脂糖）。種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，玉米漿20 g/L，尿素1.25 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO45 g/L，pH 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、玉米漿10 g/L、生物素0.05 mg/L、KH2PO40.5 g/L、VB10.5 mg/L、VB63.0 mg/L、VB120.1 g/L、(NH4)2SO410 g/L、MnSO45 mg/L、FeSO45 mg/L、MgSO40.25 g/L及CaCO310 g/L，pH 7.2。谷氨酸棒桿菌感受態(tài)制備培養(yǎng)基：酵母浸粉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，甘氨酸3 g/L，吐溫80 0.1%。谷氨酸棒桿菌電轉(zhuǎn)化恢復(fù)培養(yǎng)基：酵母浸提物2.5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，D-山梨醇91 g/L，腦心浸液18.5 g/L。固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L。必要時(shí)添加質(zhì)量濃度為30 μg/mL的卡那霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

DYCP-31DN核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；Research plus移液槍 德國(guó)Eppendorf公司；WFH-201BJ瓊脂糖凝膠像成像儀 美國(guó)GE公司；TissuePrep快速組織細(xì)胞破碎儀 杰靈科技有限公司；Mx3000P熒光定量PCR儀、XDB-C18液相色譜柱 安捷倫科技有限公司；DL-CJ-2N熒光定量PCR工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；ACQUITY高效液相色譜 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載體與引物

表1 本研究構(gòu)建質(zhì)粒Table 1 Plasmids and strains used in this study

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建載體如表1所示。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組序列為基礎(chǔ)，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行目的基因克隆引物設(shè)計(jì)，通過南京諾唯贊生物科技有限公司CE Design V1.04及Primer 5.0軟件進(jìn)行同源臂擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 PCR擴(kuò)增引物Table 2 Sequences of primers used for PCR

續(xù)表2

1.3.2 關(guān)鍵酶過表達(dá)載體構(gòu)建與發(fā)酵分析

(二)文藝影視及文學(xué)作品中的經(jīng)典臺(tái)詞。影視作品的熱播、文學(xué)作品出爐以及許多文藝節(jié)目的火爆，往往使其中的經(jīng)典臺(tái)詞備受關(guān)注，成為流行語。如：

1.3.2.1 過表達(dá)載體構(gòu)建

同源臂引物擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室篩選并保存的北京棒桿菌高酶活性目的基因AKM372I/T379W（簡(jiǎn)稱lysCm）及帶有SD序列的目的基因homL206D（簡(jiǎn)稱homm），從谷氨酸棒桿菌基因組上擴(kuò)增HAT編碼基因metX，并連接于PMD-18T重組載體上，重組載體上擴(kuò)增帶有SD序列的目的片段SD-metX。PCR條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存10 min。通過ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit連接試劑盒構(gòu)建重組載體PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX，按照說明書添加相應(yīng)試劑，混合后37 ℃反應(yīng)30 min，立即置于冰上冷卻，將待轉(zhuǎn)入100 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，取10 μL重組產(chǎn)物反應(yīng)液加入感受態(tài)細(xì)胞中，緩慢吹打混勻，冰上預(yù)冷30 min，42 ℃熱激90 s后立即冰上孵育10 min，添加600 mL LB培養(yǎng)基中，水平搖床37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min后離心去上清液，剩余菌液涂布于含30 μg/mL卡那霉素抗生素平板上進(jìn)行修復(fù)培養(yǎng)，挑取單菌落送于生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。并將測(cè)序成功的重組載體電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌。

1.3.2.2 real-time PCR分析

首先進(jìn)行引物濃度優(yōu)化，選擇200 nmol/L為引物終濃度。選取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。利用液氮組織研磨機(jī)對(duì)菌株進(jìn)行破碎處理，根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit細(xì)菌RNA提取試劑盒提取總RNA。測(cè)定RNA提取質(zhì)量，選取R值在1.8～2.0之間質(zhì)量較好的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，獲取cDNA模板進(jìn)行realtime PCR驗(yàn)證。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃終延伸5 min。其中步驟2～4重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，采集退火時(shí)間段內(nèi)熒光信號(hào)。參照-2-ΔΔCt模型處理數(shù)據(jù)。

1.3.3 過表達(dá)菌株發(fā)酵高效液相色譜分析

對(duì)構(gòu)建的過表達(dá)菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX和野生WTg1進(jìn)行72 h發(fā)酵培養(yǎng)，每6 h留取樣品，測(cè)定還原糖含量及生長(zhǎng)曲線[23-25]。對(duì)谷氨酸棒桿菌天冬氨酸家族幾種重要的氨基酸變化情況進(jìn)行分析，尋找代謝途徑阻遏原因。

配制天冬氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，每種氨基酸濃度為10 nmol/μL，根據(jù)安捷倫提供advance Bio AAA試劑和標(biāo)準(zhǔn)品說明書配制17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品。以鄰苯二甲醛及9-氯甲酸芴甲酯進(jìn)行發(fā)酵液柱前衍生，17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行液相色譜條件摸索，直到在38 min內(nèi)各峰均分離良好。流動(dòng)相A、B見表3，A、B相均用0.45 μm再生纖維素膜過濾，超聲處理充分混合。柱溫40 ℃，流速1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm（高絲氨酸265 nm），進(jìn)樣量9 μL。具體的梯度洗脫程序如表3所示。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution program

1.3.4 蘇氨酸支路thrB突變體酶活性分析

1.3.4.1 HSK體外載體構(gòu)建

采用常規(guī)CaCl2法制備BL21宿主感受態(tài)，提取谷氨酸棒桿菌基因組，同源臂引物擴(kuò)增thrB目的基因并與帶有組蛋白（His）的原核表達(dá)質(zhì)粒PET-28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET-thrB。

根據(jù)谷氨酸棒桿菌ATCC13032的thrB基因序列及其與大腸桿菌共同偏好密碼子設(shè)計(jì)引物，對(duì)thrB重組載體的底物高絲氨酸結(jié)合位點(diǎn)A20定點(diǎn)突變[26]，經(jīng)DpnI消化后熱激法轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)，活化培養(yǎng)后送于生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.4.2 酶促動(dòng)力學(xué)分析

將測(cè)序成功菌株按2%接種量轉(zhuǎn)接到100 mL LB搖瓶?jī)?nèi)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)菌體濃度（OD600nm）達(dá)到0.6時(shí)，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，25 ℃、130 r/min過夜培養(yǎng)，4 ℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，加入10 mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體，超聲破碎離心后取上清液進(jìn)行0.22 μm濾膜處理即為AK粗酶液，通過非變性鎳柱不同濃度咪唑溶液梯度洗脫去除雜蛋白，最后經(jīng)500 mmol/L咪唑洗脫得到的溶液即為thrB突變體純化液[27]。對(duì)野生型和突變體分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[28]分析。

HSK活性測(cè)定參照Lee等[29]方法略有改動(dòng)，每組3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。測(cè)定0.5～15 mmol/L不同底物濃度條件下thrB突變體純化酶活性，以米氏方程進(jìn)行非線性擬合，得到酶動(dòng)力學(xué)曲線。300 μL反應(yīng)終濃度體系：0.5 mmol/L NADH，10 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L磷酸烯醇丙酮酸，7 mmol/L KCl，3 mmol/L ATP，10 U丙酮酸激酶，15 U乳酸脫氫酶，50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），3 mol/L高絲氨酸。25 ℃溫育10 min連續(xù)監(jiān)測(cè)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)OD340nm的降低，進(jìn)而確定HSK催化L-高絲氨酸的反應(yīng)速度，每分鐘催化1 μmol高絲氨酸轉(zhuǎn)化O-磷酸高絲氨酸所需酶量為1 個(gè)酶活性單位，計(jì)算Vmax及Km值。其中Vmax表示在一定酶量下的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度呈正比。Km值表示酶促反應(yīng)的初速率為Vmax一半時(shí)的底物濃度，單位為mmol/L。

1.3.4.3 酶學(xué)性質(zhì)表征

最適溫度：野生型純化后WT-thrB酶活性最適溫度為25 ℃，反應(yīng)體系不變的情況下，在不同溫度（18、20、24、28、32、36、 40、44、48 ℃）下連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)30 min，每組樣品3 次平行，最高酶活性定義為100%。

最適pH值：野生型純化后WT-thrB酶活性最適pH 8.0，反應(yīng)體系不變的情況下，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中Tris-HCl緩沖液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)30 min，每組樣品3 次平行，最高酶活性定義為100%。

穩(wěn)定性：在最適溫度和最適pH值下，將thrB突變體純化酶加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)連續(xù)4.5 h內(nèi)測(cè)定酶活性，初始酶活性定義為100%，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活性為縱坐標(biāo)，每隔30 min檢測(cè)酶活性，每組樣品3 次平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)連接及real-time PCR分析

本研究組已對(duì)北京棒桿菌AS1.299基因組AK及HSD進(jìn)行克隆、突變和篩選研究，并對(duì)所得突變體進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，其中AK M372、T379位點(diǎn)是抑制劑賴氨酸結(jié)合口袋的關(guān)鍵殘基且高度保守，突變體AKM372I/T379W有效削弱了賴氨酸與結(jié)合口袋附近殘基的結(jié)合，解除了賴氨酸對(duì)AK的反饋抑制作用，突變后最適pH值減小，耐受范圍變廣，半衰期有所延長(zhǎng)，相比WT AK活性提高36.37 倍。HSD第206位點(diǎn)在家族中高度保守，參與底物的結(jié)合，突變成異亮氨酸后側(cè)鏈官能團(tuán)減小，空間位阻降低，更有利于與底物結(jié)合，HSDL200D相比于WT HSD活性提高了17.68 倍[30]?；驍U(kuò)增及載體構(gòu)建結(jié)果如圖1所示。圖1A中，擴(kuò)增AK目的基因lysCm為1 274 bp，擴(kuò)增HSD目的基因homm為1 338 bp，擴(kuò)增HAT目的基因metX為1 140 bp。擴(kuò)增所得長(zhǎng)度與目的片段大小相符，證明各連接目的片段擴(kuò)增成功。圖1B中，穿梭表達(dá)載體PECXK99E大小為7 018 bp，重組載體擴(kuò)增得到4 000 bp左右lysCm-SD-homm-SD-metX連接片段，證明過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 過表達(dá)基因擴(kuò)增（A）及載體構(gòu)建核酸電泳驗(yàn)證（B）Fig.1 Amplification of the overexpressed genes (A) and nucleic acid electrophoresis verification of the constructed vector (B)

以谷氨酸棒桿菌的DnaE基因作為內(nèi)參基因，對(duì)野生型谷氨酸棒桿菌WTg1及過表達(dá)菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX中l(wèi)ysC、hom和metX基因進(jìn)行real-time PCR分析。結(jié)果顯示，WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX中l(wèi)ysC、hom和metX的表達(dá)量分別為出發(fā)菌株WTg1中對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量的6.896、2.378 倍和1.659 倍，表明AK、HSD及HAT基因串聯(lián)過量表達(dá)有效。

2.2 過表達(dá)菌株高效液相色譜分析

分別對(duì)野生型菌株WTg1和過表達(dá)菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX進(jìn)行微生物發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)72 h發(fā)酵上清液進(jìn)行反相高效液相色譜檢測(cè)[31-34]，結(jié)果如表4所示。過表達(dá)菌株天冬氨酸、谷氨酸積累量降低顯著，無明顯積累；蘇氨酸和異亮氨酸產(chǎn)量同步降低；賴氨酸產(chǎn)量相應(yīng)提高，甲硫氨酸產(chǎn)量明顯提高。

表4 發(fā)酵液氨基酸質(zhì)量濃度Table 4 Concentrations of amino acids in fermentation broths g/L

過表達(dá)AK使得碳源流經(jīng)三羧酸循環(huán)后更易流經(jīng)天冬氨酸下游支路氨基酸的合成，使得Glu產(chǎn)量由原菌的1.45 g/L減少到0.07 g/L。real-time PCR分析可見過表達(dá)后HSD轉(zhuǎn)錄水平提高到2.378 倍，使得天冬氨酸積累量降低至0.09 g/L，碳流量途經(jīng)中間酶AK及HSD不會(huì)產(chǎn)生過多積累，更有利于下游氨基酸的合成。過表達(dá)HAT使蘇氨酸由原菌2.93 g/L降至1.61 g/L，賴氨酸產(chǎn)量變化不大，甲硫氨酸產(chǎn)量相比原菌提高到2.26 倍，達(dá)到4.14 g/L。

結(jié)合real-time PCR及液相色譜氨基酸分析，改造并過表達(dá)甲硫氨酸支路關(guān)鍵酶可有效促進(jìn)碳流量，減少谷氨酸棒桿菌代謝途徑中主要谷氨酸積累，提高了甲硫氨酸產(chǎn)量。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)改造后菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX代謝途徑中蘇氨酸積累量過多，是甲硫氨酸合成途徑碳流競(jìng)爭(zhēng)的第一大氨基酸。推測(cè)如果有效減少蘇氨酸產(chǎn)量將更有利于提高甲硫氨酸產(chǎn)量，故本實(shí)驗(yàn)試圖對(duì)蘇氨酸支路首個(gè)關(guān)鍵酶thrB進(jìn)行弱化研究。

2.3 thrB突變載體構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)從谷氨酸棒桿菌基因組上擴(kuò)增HSK目的基因thrB進(jìn)行PET-28a表達(dá)載體連接。進(jìn)行1%瓊脂糖核酸電泳驗(yàn)證，圖2A中，基因組擴(kuò)增thrB靶片段為1 000 bp，重組載體PET-thrB為6 369 bp，連接載體雙酶切驗(yàn)證，兩條明顯條帶分別于1 000 bp及5 000 bp左右，這與目的片段及線性化載體大小相符。圖2B為重組載體突變后PCR擴(kuò)增電泳，證明質(zhì)粒在引物作用下實(shí)現(xiàn)了大量的復(fù)制。目的片段送于生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，連接成功。

圖2 載體構(gòu)建（A）及突變PCR產(chǎn)物（B）瓊脂糖核酸電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of the constructed vector (A) and site-directed mutations (B)

2.4 thrB突變株酶活性篩選及分析

野生型和突變體經(jīng)非變性鎳柱純化后進(jìn)行12% SDSPAGE驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（圖3）。野生型和突變體純化酶在12%SDS-PAGE的37 kDa左右處均存在單一明亮條帶，表明thrB突變體蛋白在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下表達(dá)成功，可用于酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)表征。

圖3 12%SDS-PAGE分析Fig.3 12% SDS-PAGE analysis of the overexpressed protein

本實(shí)驗(yàn)對(duì)thrB進(jìn)行酸、堿、極性和非極性4 種性質(zhì)8 種氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，并對(duì)突變體進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究及酶學(xué)性質(zhì)表征，結(jié)果如表5所示。HSK 20位點(diǎn)丙氨酸突變成8 種不同氨基酸后酶活性多數(shù)降低，由各菌株Vmax可以看出其中突變體thrB-A20H及thrB-A20Y的酶活性降低較為顯著，分別為WT-thrB的43%及39%，最適溫度升高至30 ℃和35 ℃。堿性氨基酸組氨酸最適pH值增加至8.5，半衰期延長(zhǎng)，更有利于微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋氨基酸。

表5 各菌株HSK活性Table 5 HSK activity of each strain

突變體thrB-A20Y酶活性降至原菌39%，酶活性降低最為顯著，對(duì)該突變位點(diǎn)進(jìn)行原子間靜電力及Pymol圖譜分析，見圖4。靜電勢(shì)由±74.552 kJ/mol變?yōu)椤?4.573 kJ/mol，這可能是由于非極性氨基酸丙氨酸突變?yōu)闃O性氨基酸酪氨酸，導(dǎo)致氫鍵供體數(shù)增加，極性表面積增大。酪氨酸側(cè)鏈較大，與底物高絲氨酸的空間位阻增大距離變遠(yuǎn)，導(dǎo)致高絲氨酸不能很好地進(jìn)入底物結(jié)合口袋，影響酶與底物結(jié)合效率，使酶活性降低。

圖4 thrB-A20Y突變后氨基酸靜電勢(shì)及與底物之間Pymol圖Fig.4 Electrostatic potential of amino acids and Pymol diagram between amino acids and substrate after thrB-A20Y mutation

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過在谷氨酸棒桿菌內(nèi)串聯(lián)表達(dá)合成途徑關(guān)鍵酶基因LysCm、homm和metX，獲得菌株WTg1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX，有效增加了合成途徑的碳流量，使積累量大幅度提高，達(dá)到4.14 g/L，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的提高。實(shí)驗(yàn)對(duì)蘇氨酸支路關(guān)鍵酶thrB基因進(jìn)行定點(diǎn)突變研究，獲得多株酶活性降低突變株，其中thrB-A20Y活性降至原菌39%，為微生物體內(nèi)弱化蘇氨酸支路、增強(qiáng)甲硫氨酸積累提供理論基礎(chǔ)。