陳 瀅，李赤霞，陳玉娟，田元元，張 萌，韓瀠儀，王友升

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）能夠催化生物體內(nèi)環(huán)核苷酸水解，通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）的比濃度，進(jìn)而調(diào)節(jié)由環(huán)核苷酸所調(diào)控的生物體內(nèi)多種生理代謝過程[1]。該酶對細(xì)胞生命活動(dòng)起著極其重要的作用。目前研究表明，人體內(nèi)的PDE能夠?qū)π哪X血管疾病[2-3]、炎癥[4]、視覺傳導(dǎo)[5]等生理性疾病起到調(diào)控和治療的作用，于是PDE作為一種治療靶點(diǎn)進(jìn)入研究者的視線[6]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在食品工業(yè)中有非常重要的地位，廣泛應(yīng)用于釀酒工業(yè)、發(fā)酵食品、能源化工業(yè)、酵母食品以及生物防治等領(lǐng)域[7-8]。如吳軒德等[9]利用醋酸桿菌優(yōu)化S.cerevisiae在白酒的釀造中產(chǎn)生乙酸乙酯的過程；陳安特等[10]利用S.cerevisiae優(yōu)化蘿卜泡菜的發(fā)酵過程，證明S.cerevisiae能夠抑制泡菜過度酸化，并能產(chǎn)生酯類香氣；李強(qiáng)等[11]在桑葚中篩選出1 株S.cerevisiae，對葡萄采后的黑曲霉病有較好的防治效果。此外，基因組測序結(jié)果顯示，S.cerevisiae與人類基因具有約23%的同源性，許多與人類細(xì)胞代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)如細(xì)胞周期蛋白、信號(hào)蛋白等都已在酵母中發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的同源物[12-13]。

目前，已在S.cerevisiae中發(fā)現(xiàn)了兩種PDE，分別是低親和力的cAMP PDE1和高親和力的cAMP PDE2[14]。其中有研究表明S.cerevisiae PDE1基因的缺失，對S.cerevisiae發(fā)酵的磨盤柿子果酒的抗氧化能力和揮發(fā)性物質(zhì)有一定的影響[15]。但是，目前對于S.cerevisiaePDE1生物活性的報(bào)道較少，且對于如何獲得大量高純度的S.cerevisiaePDE1蛋白也沒有相關(guān)報(bào)道。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，分離純化技術(shù)的不成熟成為限制重組蛋白應(yīng)用的主要因素[16]。

本研究選擇大腸桿菌（Escherichia coli）作為表達(dá)載體，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增出的S.cerevisiae PDE1基因片段轉(zhuǎn)入其中，誘導(dǎo)表達(dá)以獲得大量的目的蛋白，并運(yùn)用多種純化方法對目的蛋白進(jìn)行純化。目前實(shí)驗(yàn)室中使用較為廣泛的是親和系統(tǒng)純化，如鄧學(xué)天等[17]應(yīng)用Ni柱純化其表達(dá)的TNF-α蛋白，獲得較高純度的目的蛋白；王博達(dá)等[18]通過Ni柱親和層析獲得4.6 倍純度的解淀粉芽孢桿菌凝乳酶，且能夠達(dá)到66.51%的回收率。Q-Sepharose純化系統(tǒng)是應(yīng)用離子交換原理進(jìn)行蛋白純化的一種手段，有學(xué)者應(yīng)用Q-Sepharose純化從白腐真菌發(fā)酵液中純化一種新的漆酶，純化效果良好[19]。分子篩純化系統(tǒng)是利用分子質(zhì)量的大小進(jìn)行純化的一種方式，金昊[20]應(yīng)用Ni柱、離子交換柱和分子篩對MCUR1蛋白進(jìn)行純化，得到高純度蛋白，且蛋白能夠應(yīng)用于蛋白結(jié)晶。本研究采用以上3 種不同的純化系統(tǒng)，依次對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行親和層析、離子交換柱和分子篩的純化，目的是得到高純度的重組目的蛋白，并進(jìn)一步研究S.cerevisiaePDE1蛋白的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌體與質(zhì)粒

野生型S.cerevisiae、E.coli感受態(tài)細(xì)胞BL21、DH5α、質(zhì)粒pET28a和pGEM-T，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、NheI內(nèi)切酶、EcoRI內(nèi)切酶 美國Biolab公司；DNA凝膠電泳回收試劑盒（純化回收DNA片段）、高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒 美國Thermo公司；Ni-NTA agarose 德國Qiagen公司；Q-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S200美國GE Healthcare公司；胰蛋白胨、酵母浸粉 中國北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

French Press高壓破碎儀 美國Glen Mills公司；層析柜 生工生物工程（上海）股份有限公司；JP61M/HV-85高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；恒溫?fù)u床 哈爾濱東聯(lián)電子儀器廠；model868 pH計(jì)、A2凈化工作臺(tái) 美國Thermo公司；5810R高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

根據(jù)S.cerevisiaePDE1基因序列（NCBI Gene ID:852644）設(shè)計(jì)引物，該基因編碼序列全長為1 110 bp。上游引物序列：5’-TCGGCTAGCATGGTTGTATTCGAAAT AA-3’；下游引物序列：5’-TCGGAATTCTTATAGAAAC AAAGTGTGGC-3’。下劃線序列分別為NheI和EcoRI的酶切位點(diǎn)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用NheI和EcoRI限制性內(nèi)切酶對pGM-T-S.cerevisiae PDE1進(jìn)行雙酶切并回收目的基因產(chǎn)物。T4連接酶將目的基因產(chǎn)物與pET28a質(zhì)粒構(gòu)建pET28a-S.cerevisiae PDE1重組質(zhì)粒并進(jìn)行DNA電泳純化后雙酶切驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，并選取陽性單克隆菌在含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將菌液進(jìn)行測序鑒定（UNC-CH Genome Analysis Facility）。

1.3.2 重組pET28a-S.cerevisiaePDE1質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將獲得的pET28a-S.cerevisiae PDE1重組質(zhì)粒熱激法轉(zhuǎn)入到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，并接種到含有50 μg/mL卡那霉素和30 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，接種至含有50 μg/mL卡那霉素、30 μg/mL氯霉素和0.4%葡萄糖的2×YT培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至A600nm為0.7，加入0.1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷低溫誘導(dǎo)（15 ℃）48 h[21]。離心收集菌體。分別對誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)24 h和48 h表達(dá)菌體測定A600nm值，并按照等菌體量進(jìn)行取樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.3 蛋白純化

1.3.3.1 菌體破碎

收集的表達(dá)菌體使用提取液按照1∶100的比例重新懸浮，F(xiàn)rench Press高壓（壓力1 200 psi）破碎菌體并對獲得的細(xì)胞破碎液分別取樣，即破碎總蛋白、離心上清蛋白和離心沉淀蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.3.3.2 基于重組蛋白多重性質(zhì)的分離純化

將離心后的上清蛋白上樣至Ni-NAT柱中進(jìn)行吸附和洗脫并收集目的蛋白[22]，將Ni-NAT柱純化后的S.cerevisiaePDE1蛋白加入2.5 mmol/L CaCl2、0.5 U/mL牛凝血酶，25 ℃、150 r/min條件下酶切2 h，切除目的蛋白的His-Tag。將酶切后的蛋白樣品進(jìn)行Q-Sepharose分離純化[23]，并將收集的蛋白濃縮到10 mL以下再進(jìn)行Sephacryl S200柱分離純化[24]，Ni-NAT、Q-Sepharose和Sephacryl S200分離純化的蛋白均進(jìn)行SDS-PAGE分析并測定其A280nm值，定義A280nm等于1時(shí)的蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，最終蛋白濃縮至10 mg/mL并冷凍保存。

1.3.4S.cerevisiaePDE1蛋白酶活性測定

參照Wang Huanchen等[25]方法：98 μL assay buffer（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5；4 mmol/L MnCl2，3H-cAMP（1∶100稀釋），1 mol/L二硫蘇糖醇）加2 μLS.cerevisiaePDE1蛋白，反應(yīng)15 min后，加入0.2 mol/L ZnSO4溶液終止反應(yīng)，再加入0.25 mol/L的Ba(OH)2溶液，離心10 min后，吸取上清液加入到30% ScintiSafe測定酶活性[25]。同時(shí)，測定5 個(gè)不同濃度下的S.cerevisiaePDE1蛋白對于cAMP和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）的底物轉(zhuǎn)化酶活性數(shù)據(jù)，按下式計(jì)算對兩種底物的轉(zhuǎn)化率：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用凝膠成像儀對電泳圖進(jìn)行分析。采用GraphPad Prism 5進(jìn)行非線性回歸得到Michaelis-Menten方程曲線，并計(jì)算R2。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

S.cerevisiae PDE1PCR擴(kuò)增的目的基因片段通過膠回收和酶切后，電泳結(jié)果見圖1?？梢钥闯瞿康幕騊CR產(chǎn)物經(jīng)酶切后在3 000 bp和1 000 bp左右均出現(xiàn)單一條帶，其中3 000 bp處為載體pGM-T條帶，1 000 bp處為目的基因條帶，從結(jié)果中能夠證明該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物分子質(zhì)量符合預(yù)期，并且酶切成功。

圖1 S.cerevisiae PDE1基因PCR產(chǎn)物酶切后DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of S.cerevisiae PDE1 gene after enzymatic digestion

圖2 pET28a-S.cerevisiae PDE1基因重組質(zhì)?；蛎盖泻驞NA電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of recombinant plasmid of pET28a-S.cerevisiae PDE1 after enzymatic digestion

目的基因酶切產(chǎn)物與質(zhì)粒酶切產(chǎn)物連接成重組pET28a-S.cerevisiae PDE1質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA電泳，酶切后膠回收。如圖2所示，重組質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)2 條帶，其中6 000 bp處是載體pET28a的基因條帶，1 000 bp處與S.cerevisiaePDE1目的基因預(yù)期片段大小一致。對重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒的插入序列與PDE1目的基因一致，證明S.cerevisiae PDE1基因重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。

2.2 重組pET28a-S.cerevisiae PDE1質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 S.cerevisiae PDE1蛋白菌體不同時(shí)間取樣SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE electrophoresis of S.cerevisiae PDE1 protein at different time points of induction

15 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，共收獲蛋白菌體5.5 g/L。在誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)24 h和48 h后分別取樣，進(jìn)行SDS-PAGE。由圖3可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，目的蛋白表達(dá)量隨之提高，分子質(zhì)量在30～45 kDa之間的蛋白含量增加迅速，這與S.cerevisiaePDE1蛋白的預(yù)期分子質(zhì)量（約40 kDa）相符。該結(jié)果表明，在該誘導(dǎo)條件下能夠獲得大量的S.cerevisiaePDE1蛋白。

2.3 重組蛋白的分離純化

2.3.1 菌體破碎與Ni-NAT柱分離純化

為判斷S.cerevisiaePDE1蛋白的水溶性和結(jié)合Ni-NAT柱的能力，確保后期能夠更好地進(jìn)行分離純化。對菌體破碎后總蛋白、離心后上清蛋白和沉淀蛋白分別取樣，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4a所示。S.cerevisiaePDE1表達(dá)菌體細(xì)胞破碎后，上清液中蛋白含量比較少，表明該蛋白誘導(dǎo)表達(dá)主要為包涵體。然而上清液表達(dá)蛋白結(jié)合Ni-NAT柱的能力較好。如圖4b所示，上清液表達(dá)蛋白和Ni-NAT柱結(jié)合時(shí)目的條帶在總條帶中比例達(dá)到70%以上，說明該上清液蛋白能通過Ni-NAT柱親和層析進(jìn)行初步分離純化，且產(chǎn)率較高。經(jīng)過Ni-NAT柱的純化，雜蛋白含量明顯減少，其中最主要的雜蛋白分子質(zhì)量約為60 kDa。

圖4 S.cerevisiae PDE1細(xì)胞破碎取樣（a）及Ni-NAT柱純化取樣（b）SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of S.cerevisiae PDE1 from disrupted cells (a)and its purified product by nickel affinity column chromatography (b)

2.3.2 蛋白酶切及Q-Sepharose柱純化

為切除S.cerevisiaePDE1蛋白的His-Tag標(biāo)簽，使其能夠更好地與Q-Sepharose柱結(jié)合，對Ni-NAT柱純化后的蛋白進(jìn)行酶切處理，而后利用Q-Sepharose系統(tǒng)進(jìn)行第2次純化。對Q-Sepharose系統(tǒng)純化的蛋白取樣進(jìn)行SDSPAGE分析，結(jié)果如圖5所示。能看出經(jīng)過Q-Sepharose系統(tǒng)純化蛋白的純度增加，雜蛋白條帶減少，但是E.coli蛋白條帶依舊未完全除去。

圖5 S.cerevisiae PDE1蛋白過Q-Sepharose柱純化后SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of S.cerevisiae PDE1 protein after purification by Q-Sepharose column chromatography

2.3.3 蛋白濃縮及Sephacryl S200柱純化

經(jīng)Q-Sepharose柱純化的蛋白離心濃縮至11 mL，上樣至Sephacryl S200柱純化。取樣SDS-PAGE結(jié)果見圖6a，經(jīng)過Sephacryl S200柱的純化，E.coli蛋白條帶已基本去除，證明經(jīng)過Sephacryl S200分子篩的純化，目的蛋白的純度得到了進(jìn)一步的提高。將純化后的蛋白濃縮取樣，進(jìn)行非變性凝膠電泳，結(jié)果見圖6b，目的蛋白能夠進(jìn)入非變性凝膠，未出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象，且?guī)缀醪缓嗑垠w蛋白。至此，經(jīng)過3 次純化后，獲得了高純度的目的蛋白，且能夠保持其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)及生物活性。

圖6 S.cerevisiae PDE1蛋白Sephacryl S200柱純化SDS-PAGE（a）及非變性凝膠電泳（b）結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE (a) and non-denaturing gel electrophoresis (b) of S.cerevisiae PDE1 protein after purification by S200 column chromatography

2.3.4S.cerevisiaePDE1蛋白酶活性分析

表1 S.cerevisiae PDE1蛋白原液酶活性Table 1 Enzymatic activity of S.cerevisiae PDE1

對純化后的PDE1蛋白進(jìn)行酶活性測定，如表1所示，PDE1蛋白活性較高，對cAMP的水解率到90%以上。進(jìn)一步證明經(jīng)3 次純化后重組目的蛋白能夠保持其原有的生物學(xué)特性。為驗(yàn)證S.cerevisiaePDE1蛋白是一種能夠同時(shí)水解cAMP和cGMP的酶，通過不同質(zhì)量濃度的蛋白水解兩種底物的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率進(jìn)行線性分析，結(jié)果如圖7所示。隨著蛋白質(zhì)量濃度的升高，底物轉(zhuǎn)化率也升高，且具有一定的線性關(guān)系。結(jié)果證明，在MnCl2催化下，150 ng/mLS.cerevisiaePDE1蛋白對3H-cAMP的底物轉(zhuǎn)化率能達(dá)到50%左右，而在300 ng/mLS.cerevisiaePDE1蛋白質(zhì)量濃度條件下，對3H-cGMP的底物轉(zhuǎn)化率能達(dá)到50.5%。此結(jié)果印證了關(guān)于S.cerevisiaePDE1蛋白是一種雙底物酶的結(jié)論，同時(shí)，也證明本實(shí)驗(yàn)純化蛋白具有很高的生物活性。

圖7 MnCl2催化條件下S.cerevisiae PDE1蛋白對3H-cAMP（a）和3H-cGMP（b）的底物轉(zhuǎn)化率Fig.7 Substrate conversion efficiency of 3H-cAMP (a) and 3H-cGMP (b)by different concentrations of S.cerevisiae PDE1 under MnCl2 catalysis

3 討 論

由于在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的過程中，E.coli自身蛋白表達(dá)以及折疊機(jī)制缺乏等原因，將會(huì)產(chǎn)生大量的雜蛋白[26]。為了提高目的蛋白的產(chǎn)率，增加蛋白純度，本研究使用最優(yōu)的誘導(dǎo)條件，獲得大量的目的蛋白表達(dá)菌體。運(yùn)用多種分離純化系統(tǒng)對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，目的是制備具有高酶活性和高純度的重組S.cerevisiaePDE1蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)關(guān)于重組蛋白的純化僅利用重組蛋白的His-Tag進(jìn)行Ni柱親和系統(tǒng)純化，如陳慧芹等[27]利用Ni柱純化羊口瘡病毒蛋白ORFV035，制造多克隆抗體；余璐璐等[28]利用Ni柱純化擬南芥氰丙氨酸合酶CYS-C1，并利用該純化蛋白制備多克隆抗體。通過對以往研究的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)用作結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的蛋白一般會(huì)使用2 種以上的純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。如吳憂[29]利用Ni柱親和層析和分子篩對人源IDO1蛋白進(jìn)行純化，得到95%以上純度的蛋白質(zhì)，并與小分子物質(zhì)進(jìn)行共晶實(shí)驗(yàn)研究；郭團(tuán)玉等[30]利用陰離子交換柱與分子篩對酵母細(xì)胞中表達(dá)的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行純化，最后制備獲得無活性突變體晶體；張?zhí)m君等[31]通過Ni柱純化以及凝膠親和層析對人源Pelota C端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行充分純化，從而獲得該結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。目前，有部分關(guān)于S.cerevisiaePDE1的功能及調(diào)控機(jī)制的研究，如蒲毅楠[32]對S.cerevisiaePDE1在細(xì)胞內(nèi)的定位與內(nèi)部調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究，認(rèn)為PDE1趨向于集中到細(xì)胞生長最為茂盛的部位調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化；馬琳等[15]對PDEs突變株S.cerevisiae發(fā)酵產(chǎn)生的果酒抗氧化性和揮發(fā)物質(zhì)差異性進(jìn)行研究，PDEs突變株相比野生菌株具有更高的發(fā)酵速度，且Δpde2/Δpde2菌株具有更高的抗氧化能力。這些研究為S.cerevisiaePDE1在酵母細(xì)胞內(nèi)的分子調(diào)控起著重要的作用。而本研究所制備的大量高純度S.cerevisiaePDE1蛋白具有極高的生物活性，能夠大量水解cAMP，利用該純化蛋白開展下一步結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究，有望通過該研究為胞外調(diào)控S.cerevisiae細(xì)胞的生長代謝打下基礎(chǔ)。