曲 敏，吳 征，杜婷婷，朱秀清，陳鳳蓮，李凌俐，盧曼曼

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

冰結(jié)構(gòu)蛋白（ice structuring proteins，ISPs），又稱抗凍蛋白或熱滯蛋白，是我國于2006年批準(zhǔn)可用于冷凍食品的新型添加劑。ISPs可由多種生物如魚類，植物及昆蟲體內(nèi)所合成以保證其在低溫生存[1-2]。它能以非依數(shù)形式降低水溶液冰點，具有熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA），可與冰表面不可逆結(jié)合，通過修飾冰晶形態(tài)來抑制冰晶產(chǎn)生和生長，使已有冰晶體顆粒大小之間重新分配，抑制冰晶重結(jié)晶[3-5]。Liu Mei等[6]發(fā)現(xiàn)重組胡蘿卜抗凍蛋白可有效減少凍藏產(chǎn)生的冰晶數(shù)量，顯著提高了冷凍面團(tuán)所制面包的質(zhì)量；潘振興等[7]發(fā)現(xiàn)冰結(jié)構(gòu)蛋白對長期凍藏冷凍面團(tuán)發(fā)酵特性與超微結(jié)構(gòu)的抗凍保護(hù)作用。而冷凍面團(tuán)品質(zhì)下降的主要原因是，面筋蛋白在冷凍過程中品質(zhì)發(fā)生劣變[8]。因此，研究ISPs在冷凍過程中對面筋蛋白的品質(zhì)影響，可為改善冷凍面團(tuán)品質(zhì)提供依據(jù)。

紫花苜蓿俗稱金花菜，是重要的豆科牧草，亦可食用。其鮮品中蛋白含量高達(dá)18%以上。苜蓿耐寒能力極強(qiáng)，在-45 ℃極寒條件下返青率仍達(dá)90%。本課題組在前期研究中，以紫花苜蓿干草為原料，采用冰結(jié)合磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白（alfalfa ice-structuring proteins，AISPs），混合蛋白電泳結(jié)果顯示，AISPs由兩2 個組分組成，其分子質(zhì)量分別約為34 kDa和52 kDa，經(jīng)差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀檢測THA為0.54 ℃，且其冰晶體積小、數(shù)量多，多呈菱形，具有很好的抗凍活性[9]。將AISPs添加到冷凍面團(tuán)中，冷凍面團(tuán)的硬度明顯降低，彈性、回復(fù)性和內(nèi)聚性稍增大，咀嚼性有所下降，改善了冷凍面團(tuán)的品質(zhì)[10]。將AISPs添加到速凍餃子皮中，速凍餃子皮的持水性顯著提高，無明顯開裂或無開裂。掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）結(jié)果顯示，AISPs有效地改善了濕面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并對生、熟餃子皮的質(zhì)構(gòu)特性產(chǎn)生了影響，可有效地保護(hù)餃子皮質(zhì)地的均一性及穩(wěn)定性[9]。本研究以苜蓿干草為原料提取AISPs，對其氨基酸組成及分離純化后不同組分的THA、糖蛋白和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并將其與冷凍濕面筋粉混合，檢測濕面筋蛋白持水性、可凍結(jié)水含量、蛋白分子質(zhì)量及微觀結(jié)構(gòu)的變化。探究AISPs對冷凍濕面筋的品質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北大荒高筋面包粉 黑龍江北大荒有限公司；“肇東”紫花苜蓿 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所蘭西苜蓿種植基地；考馬斯亮藍(lán)G250 上?？萍及l(fā)展有限公司；乙醇、叔丁醇、戊二醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、雙丙烯酰胺（均為分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；ZLG-10型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海中勝生物技術(shù)公司；Z366高速大容量離心機(jī) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；EMS-9A磁力攪拌器 天津歐諾儀器儀表有限公司；SE-3400N SEM 日本日立公司；Q200 DSC儀 美國TA公司；TDL80-2B臺式小離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；Nexus-470傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 AISPs的提取

參考文獻(xiàn)[11]中改進(jìn)的冰球結(jié)合磷酸緩沖溶液法提取AISPs。將得到的冰提AISPs溶液冷凍干燥，即得AISPs凍干粉，備用。

1.3.2 AISPs的氨基酸組成分析

參照賈青慧等[12]的方法進(jìn)行測定。

1.3.3 AISPs分離純化

參照張延紅等[13]的方法進(jìn)行改進(jìn)分離純化AISPs。經(jīng)檢測AISPs的等電點為3.4，故采用陰離子交換色譜柱DEAE-52進(jìn)行分離純化。分離條件為：離子交換洗脫液pH 8.0、緩沖液濃度20 mmol/L、上樣量1 mL，上樣質(zhì)量濃度40 mg/mL。收集各洗脫峰，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待液體濃縮至10 mL左右停止旋蒸，裝入透析袋，2～3 h更換一次透析液，透析48 h后經(jīng)冷凍干燥，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液進(jìn)行后續(xù)鑒定。

1.3.4 AISPs分離組分的THA檢測

參照曲敏等[9]方法進(jìn)行測定。THA與冰核含量計算方法如下：

式中：Th為保留溫度；T0為在不同停留溫度下體系的開始結(jié)晶溫度。

式中：Φ為冰晶質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；ΔHf、ΔHm分別為AISPs溶液的結(jié)冰焓和熔融焓。

1.3.5 AISPs分離組分糖蛋白的鑒定

參照劉翠芳等[14]的方法并改進(jìn)。將含有樣品的濾紙浸在70%乙醇溶液中，片刻后吹干，在高碘酸溶液中浸5 min，用70%乙醇溶液清洗后于還原液中浸5～8 min，用70%乙醇溶液清洗，在亞硫酸-品紅溶液中浸24～25 min后用亞硫酸鹽沖洗3 次，乙醇脫水后，吹干。

1.3.6 AISPs分離組分的FTIR檢測

參照張秋會等[15]的方法并改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取1 mg待測樣品，加入100 mg溴化鉀，研磨均勻后進(jìn)行壓片，進(jìn)行FTIR的測定。測定波數(shù)在4 000～400 cm-1之間的吸收光譜，波數(shù)精度為0.01 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次。

1.3.7 面筋蛋白干粉的制備

參照姜小苓等[16]的方法并改進(jìn)。稱取150 g脫脂小麥面粉，加入100 mL蒸餾水（不超過20 ℃）揉成面團(tuán)后，置于含500 mL蒸餾水的1 L大燒杯中，靜置30 min。經(jīng)過一系列蒸餾水揉洗（2×300 mL，2×150 mL，4×100 mL，4×75 mL和6×50 mL），得面筋蛋白組分，將其冷凍干燥后，粉碎、過80 目篩，即為面筋蛋白干粉。

1.3.8 濕面筋樣品的凍藏與凍融處理

將面筋蛋白干粉分別與添加量0%、0.5%、1%、1.5%的AISPs凍干粉充分混勻，溶于蒸餾水中。一組于-18 ℃及-40 ℃凍藏1、3、5、7 周；另一組于-18 ℃及-40 ℃凍融1、3、5、7 周（每周解凍1 次）。測定前在室溫下進(jìn)行解凍。

1.3.9 濕面筋蛋白持水性的測定

參照李翠翠等[17]的方法并改進(jìn)。取解凍后的樣品以10 000 r/min離心15 min，倒掉離心出來的液體，以離心前后樣品的質(zhì)量差與樣品質(zhì)量的比值，評估樣品的持水性。

1.3.10 濕面筋蛋白可凍結(jié)水含量的測定

參照錢曉潔等[18]的方法并改進(jìn)。取面筋蛋白樣品10 mg放在鋁制坩堝中進(jìn)行壓片。將坩堝放入DSC中，在-15 ℃和5 ℃保持5 min，然后從-15 ℃升溫到5 ℃，升溫速率為1 ℃/min。

1.3.11 濕面筋蛋白的SDS-PAGE測定

參照張延紅等[13]的方法并改進(jìn)。采用12%分離膠、4%濃縮膠，電泳初始電壓100 V，待條帶跑至濃縮膠與分離膠界面時改為80 V。電泳結(jié)束后，染色、脫色處理，拍照。用Quantity One軟件對電泳圖進(jìn)行分子質(zhì)量分析與確定。

1.3.12 冷凍濕面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察

參照郭金英等[19]的方法并改進(jìn)。將干燥樣品固定在樣品臺上，用鍍膜儀鍍上金屬膜，置于SEM下觀察樣品的結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)平行測定3 次，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以±s表示；用Microsoft Excel 2010軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AISPs的氨基酸組分分析

由表1可以看出，AISPs含17 種氨基酸。含量最多的為天冬氨酸占1.75%，其次是谷氨酸占1.64%，兩者皆為親水性氨基酸。含量最低的是蛋氨酸占0.07%。親水性與疏水性氨基酸的比例約為7∶4，說明AISPs具有較強(qiáng)的親水性，可與冰晶表面水分結(jié)合，從而修飾冰晶形態(tài)、抑制冰晶生長。

2.2 AISPs組分的鑒定

2.2.1 AISPs組分的分離

從圖1A可以看出，共有4 條洗脫峰。對分離出的AISPs蛋白組分進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測，結(jié)果如圖1B所示，可以看出條帶清晰的P2、P4組分分別約為34、52 kDa，故取其進(jìn)行后續(xù)檢測。

表1 氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition of AISPs

圖1 AISPs組分的層析譜圖（A）及SDS-PAGE檢測結(jié)果（B）Fig.1 Chromatographic separation (A) and SDS-PAGE (B) of AISPs

2.2.2 THA的DSC檢測結(jié)果

表2 AISPs P2組分的THA檢測結(jié)果Table 2 THA measurement of component P2 of AISPs

表3 AISPs P4組分的THA檢測結(jié)果Table 3 THA measurement of component P4 of AISPs

圖2 AISPs組分的DSC熱流曲線Fig.2 DSC heat flow curve of AISPs components

由表2、3和圖2可看出，隨著停留溫度升高，放熱曲線面積變大，處于該停留溫度下的冰核質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少。P2組分隨著停留溫度升高，THA逐漸降低，當(dāng)停留溫度從-0.75 ℃升高至-0.29 ℃時，冰核質(zhì)量分?jǐn)?shù)從73.86%降至33.63%；P4組分，隨著停留溫度升高，THA先穩(wěn)定后降低，當(dāng)停留溫度從-0.75 ℃升高至-0.28 ℃時，冰核質(zhì)量分?jǐn)?shù)從74.94%降至35.41%；P2組分的THA為0.37～0.41 ℃，P4組分的THA為0.32～0.41 ℃，均接近沙冬青葉ISPs的0.46 ℃[20]，表明AISPs組分的THA良好。而本研究組實驗前期研究的AISPs混合組分的THA為0.54 ℃[21]，說明分離后AISPs的單一組分的THA有所降低。

2.2.3 AISPs的糖蛋白鑒定結(jié)果

圖3 AISPs的糖蛋白鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of AISPs as glycoprotein

過碘酸可把糖類相鄰2 個碳上的羥基氧化成醛基，用Schiff試劑和醛基反應(yīng)使糖類呈現(xiàn)紫紅色。如圖3所示，利用Schiff染色法對P2、P4組分進(jìn)行染色，顯色反應(yīng)的結(jié)果如箭頭處所示：P2組分呈現(xiàn)紫紅色，表明34 kDa組分為糖蛋白；而P4組分無顯色反應(yīng)，表明52 kDa組分為非糖蛋白。

2.2.4 AISPs的FTIR檢測結(jié)果

酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）和酰胺III帶（1 220～1 330 cm-1）是蛋白質(zhì)的特征譜帶，其振動頻率取決于C＝O和N-H之間的氫鍵性質(zhì)，為特征振頻率，反映了AISPs 2 個組分的特定二級結(jié)構(gòu)。在酰胺I帶中，1 618～1 640 cm-1為β-折疊；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋；1 640～1 650 cm-1為無規(guī)卷曲；1 660～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角。從圖4a顯示，由于P2組分的特征峰譜帶相互疊加，1 631 cm-1屬于酰胺I帶的β-折疊的特征峰，采用peakfit軟件對該范圍峰進(jìn)行分解擬合分析。圖4b的擬合曲線顯示，1 653 cm-1為α-螺旋，1 613、1 635、1 622、1 628 cm-1為β-折疊，1 664 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 644 cm-1為無規(guī)卷曲。從圖4c顯示，1 641.31cm-1屬于酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）吸收峰，1 641cm-1屬于β-折疊的特征吸收峰；酰胺III帶出現(xiàn)圓頭峰。通過peakfit進(jìn)行擬合，從圖4d可以看出，1 652.48 cm-1為α-螺旋，1 610.63、1 620.38、1 628.73、1 635.07 cm-1為β-折疊，1 662.48、1 673.77、1 685.39 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 642.8 cm-1為無規(guī)卷曲。二級結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果見表4。

圖4 AISPs組分的FT-IR圖譜及酰胺I帶FTIR擬合圖譜Fig.4 FTIR spectra and AISPs components and curve fitting of amide I band

表4 AISPs P2、P4組分二級結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果Table 4 Secondary structure composition of AISPs P2 and P4

從表4得出，AISPs的34 kDa組分的二級結(jié)構(gòu)比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉(zhuǎn)角∶無規(guī)卷曲=13.19∶60.21∶12.21∶19.16；52 kDa組分的二級結(jié)構(gòu)比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉(zhuǎn)角∶無規(guī)卷曲16.87∶39.41∶26.69∶17.03。Yu Zhao等[22]采用拉曼光譜對天然SPI的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其含有較多的β-折疊結(jié)構(gòu)，其含量為55.2%，而α-螺旋結(jié)構(gòu)較少，含量僅為14.4%，這與2.2.4節(jié)得到的天然AISPs二級結(jié)構(gòu)的含量相近。

2.3 冷凍濕面筋蛋白持水性與可凍結(jié)水含量的變化

2.3.1 冷凍濕面筋蛋白持水率的變化

圖5 －18 ℃不同AISPs添加量下凍藏凍融濕面筋蛋白持水率的變化Fig.5 Changes in water-holding capacity of frozen-thawed wet gluten with different amounts of AISPs added at -18 ℃

圖6 －40 ℃不同AISPs添加量下凍藏凍融濕面筋蛋白持水率的變化Fig.6 Changes in water-holding capacity of frozen-thawed wet gluten with different amounts of AISPs added at -40 ℃

圖5、6對比可知，在-18 ℃和-40 ℃時，添加不同濃度AISPs的凍藏凍融濕面筋蛋白持水率較空白組均有所上升，但-18 ℃的持水率上升幅度較小，說明AISPs在-40 ℃低溫處理時作用效果更為顯著，故后續(xù)研究及討論均在-40 ℃進(jìn)行。

從圖6可以看出，隨著冷凍時間的延長，凍藏和凍融各組的濕面筋蛋白持水率均呈下降趨勢。凍藏和凍融對照在3、5、7 周后，持水率大幅度下降，且凍融處理比凍藏處理的下降幅度更大，說明對濕面筋破壞作用更為顯著。不同添加量的AISPs，不同程度地緩解了下降趨勢，其中，添加0.5%和1% AISPs組的效果明顯高于對照和1.5%組，其中1% AISPs組的總體效果更突出，凍藏組較對照分別提升了3.42%、5.79%、4.85%；凍融較對照分別提升了2.82%、3.39%、6.27%。說明由于溫度波動產(chǎn)生的冰晶重結(jié)晶現(xiàn)象進(jìn)一步破壞了面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，添加AISPs對冷凍濕面筋蛋白的持水性具有保護(hù)作用，保護(hù)了水分的流失，且不同AISPs添加量、不同冷凍方式對濕面筋蛋白持水率的影響有差異。

2.3.2 冷凍濕面筋可凍結(jié)水含量的變化

由圖7可以看出，隨著冷凍時間的延長，凍藏組和凍融組的濕面筋蛋白可凍結(jié)水含量均逐漸增加。不同添加量的AISPs，不同程度地緩解了上升趨勢，其中，添加0.5% AISPs組效果最好。在冷凍處理3、5、7 周后，凍藏組較對照分別下降了4.55%、4.49%和4.30%；凍融組較對照分別下降了3.37%、2.17%和3.16%。說明在冷凍過程中，濕面筋中水分發(fā)生結(jié)晶，其中的半結(jié)合水因與高分子物質(zhì)結(jié)合不緊密而發(fā)生遷移，小冰晶不斷聚集形成大冰晶，刺破面筋的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致持水率下降及水分流失，可凍結(jié)水含量增加[23]。而AISPs的添加減緩了可凍結(jié)水含量的上升趨勢。說明AISPs可以降低溶液的凝固點，在范德華力、疏水性相互作用和氫鍵作用下吸附到面筋蛋白體系中冰核表面，抑制凍結(jié)過程中的冰晶生長和再結(jié)晶[24]，減少了冰晶對濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞，阻止了水分從面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中離析[25]。

圖7 AISPs對濕面筋凍藏凍融過程中熔化焓值變化的影響Fig.7 Effect of AISPs on the change in melting enthalpy of wet gluten during freezing-thawing process

此外，當(dāng)AISPs添加量為1.5%時，凍藏1 周時持水率小于對照，5、7 周后，高于對照、卻小于其他添加量；凍融組中雖一直高于對照，卻小于其他添加量。Carpenter[26]和蔡路昀[27]等發(fā)現(xiàn)ISPs相對濃度較低時可顯著提高紅細(xì)胞的存活率；而較高濃度將致使紅細(xì)胞的存活率降低。因此，當(dāng)AISPs的添加濃度較低，體現(xiàn)出抑制濕面筋體系中大冰晶形成及對面筋蛋白的破壞，有效地鎖住了水分；而AISPs較高濃度時，促進(jìn)了大冰晶的形成，對濕面筋蛋白的破壞作用開始顯現(xiàn)，導(dǎo)致持水性下降。說明，AISPs的添加量與濕面筋持水性及可凍結(jié)水含量的抗凍保護(hù)作用存在著一定的量效關(guān)系。

2.4 AISPs對冷凍濕面筋蛋白分子質(zhì)量的影響

采用Quantity One軟件分析圖7中各濕面筋蛋白樣品的電泳條帶及分子質(zhì)量，結(jié)果如圖8所示。

小麥面筋蛋白由麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、麥清蛋白及麥球蛋白組成，其中麥醇溶蛋白約占蛋白質(zhì)總量的50%，其分子質(zhì)量范圍為30～80 kDa，根據(jù)其在低pH值下電泳遷移率的不同可分為α-、β-、γ-、ω-麥醇溶蛋白4 種類型[17]。α-、β-、γ-麥醇溶蛋白的分子質(zhì)量范圍為30～50 kDa，ω-麥醇溶蛋白的分子質(zhì)量范圍在45～75 kDa之間。麥谷蛋白約占蛋白質(zhì)總量的35%～45%，其亞基可分為HMW-GS和LMW-GS。HMWGS可分為X、Y兩種類型，分子質(zhì)量分別為80～90 kDa和65～75 kDa。LMW-GS可分為B、C、D 3 種類型，C、D型分子質(zhì)量分別為20～40、50～70 kDa，大多數(shù)為B型分子質(zhì)量為30～40 kDa[28]。麥谷蛋白和麥醇溶蛋白分別決定面團(tuán)的黏彈性和延展性，對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、冷凍面團(tuán)及冷凍面食品的質(zhì)量產(chǎn)生很大影響。

圖8 凍藏與凍融濕面筋蛋白樣品的分子質(zhì)量變化趨勢Fig.8 Changes in molecular mass of frozen and freeze-thaw gluten samples

從圖8可以看出，經(jīng)過凍藏處理的濕面筋蛋白分子質(zhì)量呈下降趨勢，分子質(zhì)量范圍在14～70 kDa之間。隨著冷凍時間的延長，65～75 kDa的蛋白組分完全消失，14.4～30 kDa的組分顯著增加。其中，ω-麥醇溶蛋白部分降解，麥谷蛋白HMW-GS全部降解，LMW-GS的B亞基和C亞基較穩(wěn)定，D亞基有不同程度的增加，尤其在凍藏5 周和7 周時D亞基組分的增加進(jìn)一步加大。AISPs添加組的濕面筋蛋白組分較對照均有低分子質(zhì)量組分的不同程度增加，其中0.5% AISPs的濕面筋蛋白分子質(zhì)量變化較大，如對D亞基分子質(zhì)量的影響偏大，凍藏3 周時對照組的D亞基分子質(zhì)量為39.23 kDa，0.5%AISPs的在5 周則增加至47.79 kDa。說明在低溫冷凍破壞了維持HMW-GS和ω-麥醇溶蛋結(jié)構(gòu)的作用鍵，使得蛋白質(zhì)發(fā)生伸展和降解。冰晶的重結(jié)晶和水分的重新分布使LMW-GS/HMWGS的比率呈現(xiàn)出較為明顯的增大趨勢[29-30]。

從圖8可以看出，經(jīng)過凍融處理后的濕面筋蛋白分子質(zhì)量同凍藏處理的結(jié)果，亦呈下降趨勢，總體范圍處在12～60 kDa之間，其中ω-麥醇溶蛋白、麥谷蛋白HMWGS及LMW-GS的B、C、D亞基的變化也同凍藏處理結(jié)果相仿。而隨著凍融次數(shù)的增加，低分子質(zhì)量蛋白進(jìn)一步增加，明顯多于凍藏處理。B、C、D亞基發(fā)生了不同程度的增加，其中主要集中在B亞基和C亞基的增加。加入AISPs后，在一定程度上緩解了蛋白組分降解。以AISPs添加量為1%時最佳，此時凍融處理后在35～66.2 kDa分子質(zhì)量的蛋白顯著增加。Ribotta[31]和Sharadanant[32]等認(rèn)為冷凍處理不再使低分子質(zhì)量蛋白發(fā)生降解，與本實驗結(jié)果有差異。分析原因為加入AISPs后，冰晶的形態(tài)被修飾成規(guī)則的六邊形狀，對蛋白聚集體的破壞力減弱，從而緩解了高分子蛋白的解聚，且與蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物理截留作用存在很大的關(guān)系[33-34]。

由圖8可知，經(jīng)凍融處理后，分子質(zhì)量為61.26～71.96 kDa的蛋白組分全部降解，經(jīng)凍融處理濕面筋蛋白全部蛋白組分的分子質(zhì)量較凍藏低，說明低溫反復(fù)凍融對麥谷蛋白聚集體的破壞更為嚴(yán)重。但添加AISPs凍融處理的樣品表現(xiàn)出高分子質(zhì)量解聚與低分子質(zhì)量聚集的現(xiàn)象有所減緩，說明AISPs對凍融濕面筋蛋白具有一定的抗凍保護(hù)作用。

2.5 濕面筋SEM微觀結(jié)構(gòu)表征

由圖9可見，濕面筋蛋白超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出多孔的三維立體網(wǎng)絡(luò)狀，呈連續(xù)纖維狀的為麥谷蛋白聚合體，而較小的麥醇溶蛋白則穿插其中。凍藏1 周時面筋蛋白呈網(wǎng)眼狀緊密相連且蛋白孔洞大小均勻且光滑，表明蛋白結(jié)構(gòu)致密統(tǒng)一，具有較好的穩(wěn)定性[35]。隨著凍藏時間的延長，面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的黑色孔洞逐漸變大，這是由于濕面筋蛋白冷凍時，其中的水分形成冰結(jié)晶分布在面筋蛋白基質(zhì)的各個部位，速凍后冰晶升華成汽體從面筋蛋白中溢出，冰晶體原來所處位置便成為空穴[36]。與同組樣品凍藏條件濕面筋蛋白超微結(jié)構(gòu)相比，凍融條件下，濕面筋蛋白面筋碎片增多，產(chǎn)生了大量不規(guī)則孔洞，質(zhì)地粗糙、面筋纖維束斷裂，說明凍融循環(huán)對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞更大。劉國琴等[37]認(rèn)為凍融處理會導(dǎo)致溫度發(fā)生波動而產(chǎn)生等質(zhì)量重結(jié)晶、遷移重結(jié)晶和晶體生長等重結(jié)晶現(xiàn)象。此外，凍融處理可引起濕面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)物化性質(zhì)的改變，凍藏凍融處理后的濕面筋蛋白持水性下降，導(dǎo)致組分中游離水增多，可凍結(jié)水形成冰晶后體積增加，其異常的膨脹特性使得蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到擠壓而破壞[38]。Kontogiorgos等[39]發(fā)現(xiàn)由于水與蛋白質(zhì)的相互作用，可以增加水合結(jié)構(gòu)中原子-原子間相互作用，高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)體系如麥谷蛋白，在冷卻過程中會發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，從而減緩對面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的損害。說明，低溫凍藏與凍融處理破壞麥谷蛋白HMW-GS后，導(dǎo)致其不同程度的降解，進(jìn)而加劇了對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的破壞。SEM結(jié)果與本實驗前期對濕面筋蛋白電泳及其分析結(jié)果相印證。

圖9 －40 ℃凍藏和凍融處理的濕面筋蛋白超微結(jié)構(gòu)（×1 000）Fig.9 Ultrastructure of frozen and thawed wet gluten at -40 ℃ (× 1 000)

與對照組相比，AISPs的添加均使面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)得到明顯改善。對比不同添加量，當(dāng)AISPs添加量為1%時，孔壁厚且較為光滑；面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重新交聯(lián)，孔洞重新排布，使得面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)支撐力加強(qiáng)。說明AISPs可抑制冰晶形成，使冷凍濕面筋蛋白內(nèi)外部的可凍結(jié)水形成相對較小且均勻的冰晶，對面筋蛋白具有抗凍保護(hù)作用，可提高冷凍面制品的品質(zhì)[40]。

濕面筋蛋白的持水率和可凍結(jié)水含量的變化，反映了水分的存在方式和遷移規(guī)律，在一定程度上佐證了冷凍條件下，濕面筋蛋白組分的分子質(zhì)量及SEM網(wǎng)絡(luò)表征的變化趨勢。綜上確定，AISPs添加量為1%時，對-40 ℃條件下凍融樣品的抗凍保護(hù)效果最優(yōu)。

3 結(jié) 論

AISPs含17 種氨基酸，親水性與疏水性氨基酸的比例為7∶4；對AISPs進(jìn)行分離后，得到34、52 kDa兩個分離組分，前者為糖蛋白，后者為非糖蛋白；34 kDa組分的THA為0.37～0.41 ℃，52 kDa組分的THA為0.32～0.41 ℃。34 kDa組分的二級結(jié)構(gòu)比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉(zhuǎn)角∶無規(guī)卷曲=13.19∶60.21∶12.21∶19.16；52 kDa組分的二級結(jié)構(gòu)比例為α-螺旋∶β-折疊∶β-轉(zhuǎn)角∶無規(guī)卷曲=16.87∶39.41∶26.69∶17.03。

在-18 ℃和-40 ℃分別凍藏與凍融處理濕面筋蛋白，顯示添加不同濃度AISPs各組的持水率下降趨勢減緩，且對-40 ℃處理樣品的保護(hù)效果更為顯著。

隨著凍藏時間的延長和凍融周期的增加，濕面筋蛋白的持水性呈下降趨勢，可凍結(jié)水含量逐漸增加，凍融組均高于凍藏組。添加AISPs后，持水率下降和可凍結(jié)水上升趨勢減緩。且AISPs的添加量與濕面筋蛋白持水性及可凍結(jié)水含量的抗凍保護(hù)作用存在著一定的量效關(guān)系。

經(jīng)電泳和Quantity One軟件分析，隨著凍藏時間的延長，濕面筋蛋白的ω-麥醇溶蛋白部分降解，HMW-GS全部降解，LMW-GS的B亞基和C亞基較穩(wěn)定，D亞基有所增加；隨著凍融次數(shù)的增加，低分子質(zhì)量蛋白進(jìn)一步增加，明顯多于凍藏。B、C、D亞基發(fā)生了不同程度的增加，主要集中在B亞基和C亞基的增加。加入AISPs后，在一定程度上緩解了蛋白組分降解。并促使低分子質(zhì)量組分有不同程度增加，其中0.5% AISPs和1% AISPs分別對凍藏和凍融樣品的影響較大。

SEM表征結(jié)果顯示，隨著凍藏時間的延長和凍融周期的增加，面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，出現(xiàn)大量不規(guī)則、質(zhì)地粗糙的孔洞。AISPs的添加使?jié)衩娼罹W(wǎng)絡(luò)得以清晰連續(xù)。