曹璇，鄭曉冬

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，杭州310058）

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）是一類好氧菌，在25～30 ℃條件下可以快速生長。YAN等發(fā)現(xiàn)，從果園土壤中分離出的季也蒙畢赤酵母菌株（Y1）可以直接抑制梨果實表面擴展青霉（Penicillium expansum）的生長[1]；高云慨等發(fā)現(xiàn)，從海南杧果園取樣分離到的季也蒙畢赤酵母菌株（LZ5）對杧果采后炭疽病菌有明顯的抑制效果[2]；丁玥等的試驗證明，季也蒙畢赤酵母可以有效控制番茄貯藏期灰霉病的發(fā)生[3]。同時，RANGARAJAN等[4]、SIM等[5]、SHARMA等[6]的研究證明，部分生防菌種經(jīng)外界逆境脅迫培養(yǎng)后，可以明顯增強其對農作物或果蔬采后病害的防治效果。由于季也蒙畢赤酵母對果蔬采后具有較好的生物防治效果，近年來受到國內外研究者的廣泛關注。筆者所在實驗室曾于海南省三沙市西沙群島海沙中分離得到1株季也蒙畢赤酵母（保藏號：CGMCC 17240），試驗證明此酵母菌株對櫻桃番茄果實灰霉病有一定的抑制作用，并且試驗還證明該酵母菌株有一定的耐鹽性，在12%NaCl脅迫培養(yǎng)條件下仍可生長，且經(jīng)鹽逆境脅迫培養(yǎng)后其生防效果有所提升。

轉錄組學是了解基因組遺傳信息與生物功能的橋梁[7]，使用Illumina公司高通量測序平臺的轉錄組測序技術，可以在不需要知道物種基因組詳細信息的條件下獲得某一物種在特定狀態(tài)下幾乎所有轉錄本的序列信息[8-9]。且轉錄組數(shù)據(jù)會隨著生物體的生長發(fā)育情況及所處環(huán)境狀態(tài)發(fā)生變化，因此，對轉錄組進行分析可以幫助我們有效研究生物在逆境脅迫下應激生理的作用機制[10]。本研究利用轉錄組測序技術對經(jīng)鹽脅迫與未經(jīng)鹽脅迫培養(yǎng)后的M.guilliermondii 進行轉錄組測序，對篩選得到的差異表達基因進行基因本體（gene ontology,GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，旨為M.guilliermondii的耐鹽機制及其進一步研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）為筆者所在實驗室于海南省西沙群島海沙中分離得到，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC 17240。

1.1.2 樣品制備

從保藏斜面上挑取少許季也蒙畢赤酵母接種于營養(yǎng)酵母葡萄糖瓊脂（nutrient yeast dextrose agar,NYDA）固體培養(yǎng)基（牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，用水定容至1 000 mL，于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min）上，25 ℃靜置培養(yǎng)48 h以進行活化；再用接種環(huán)將活化好的菌株接種到50 mL 營養(yǎng)酵母葡萄糖液體（nutrient yeast dextrose broth,NYDB）培養(yǎng)基中，置于250 mL錐形瓶內，于28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h；隨后吸取1 mL上述菌液分別加入到50 mL NYDB培養(yǎng)基和50 mL 12%NaCl-NYDB培養(yǎng)基（牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，氯化鈉120 g，用水定容至1 000 mL，于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min）中，再于28 ℃、200 r/min條件下傳代培養(yǎng)24 h。收集一定體積的上述2 種培養(yǎng)液，在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min，對離心收集所得菌體用無菌水洗滌2次，棄上清液，轉移至凍存管中，立即放入液氮進行速凍，并且于－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 儀器與設備

MLS-3750 全自動滅菌鍋（日本Sanyo 公司）；SW-CJ-1F 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；SIGMA 3K-15 離心機（德國Sigma 公司）；QYC-211全溫空氣搖床（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；LRH-250 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PTC-225熱循環(huán)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）儀（美國Bio-Rad公司）；一步法實時熒光PCR儀（美國ABI公司）；Oligo（dT）磁珠試劑盒（武漢哇哇噻納技術開發(fā)有限公司）；PrimeScriptTM單鏈cDNA 合成反轉錄酶試劑盒、PrimeScriptTM雙鏈cDNA 合成試劑盒、RNAiso Plus 動物/植物/微生物/培養(yǎng)細胞總RNA 提取試劑盒、PrimeScriptTM除去基因組DNA 反轉錄試劑盒、TB GreenTM嵌合Ex TaqTM熒光定量PCR 試劑盒，均由日本TaKaRa公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA 的提取與文庫的構建

采用Invitrogen Trizol 試劑（美國Thermo Fisher科技公司）[11]提取2 種培養(yǎng)條件（鹽脅迫和非鹽脅迫）下M. guilliermondii 的總RNA，利用Nanodrop（美國Thermo Fisher 科技公司）檢測RNA 純度，然后利用Qubit 2.0 對RNA 濃度進行精確定量，使用Aglient 2100 檢測RNA 樣品的完整性。樣品檢測合格后，首先用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物的mRNA，隨后加入緩沖碎片將mRNA打斷成短片段，以mRNA 為模板，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成第1鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs 和DNA 聚合酶Ⅰ和RNaseⅡ合成第2 鏈cDNA，再用AMPure XP磁珠純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA 先進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭，再用AMPure XP磁珠進行片段大小選擇。最后進行PCR擴增，得到最終的DNA擴增文庫。文庫構建完成后，分別使用Qubit 2.0和Agilent 2100對文庫的濃度和插入片段大小進行檢測，使用定量PCR（quantitative PCR,qPCR）對文庫濃度進行準確定量（文庫有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫質量。

1.3.2 測序及數(shù)據(jù)過濾

庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標上機數(shù)據(jù)量的需求合并后進行Illumina HiSeqTM高通量測序，得到原始測序序列（raw reads）。本試驗所有測序工作在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。為了保證信息分析質量，數(shù)據(jù)分析之前需先對原始測序序列進行過濾：1）去除帶接頭的測序序列；2）去除未知堿基N 比例大于10%的測序序列；3）去除過大過小等低質量的測序序列，以得到高質量序列（clean reads）。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)的分析

本試驗研究的M.guilliermondii為非模式生物，目前無相關全基因組測定結果。對于無參考基因組的轉錄組分析，采用Trinity 法[12]將測序所得的高質量序列拼接成轉錄本（mRNA 序列），用Corset 程序對轉錄本進行層次聚類，以聚類后的序列為參考，在此基礎上進行基因結構注釋、基因表達水平分析、差異基因功能注釋和富集分析等。

1.3.4 實時熒光定量反轉錄PCR（real time quantitative reverse polymerase chain reaction, RT-qPCR）對轉錄組結果的驗證

cDNA 模板合成步驟參照去基因組DNA PrimeScriptTM反轉錄試劑盒［RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）］說明書，用無菌水對反轉錄樣品進行梯度（2、4、6、8、10倍）稀釋，并以稀釋后的cDNA 為模板進行qPCR 反應（每個濃度設置3 個重復），選取CT值在15～25 間的cDNA 的合適稀釋倍數(shù)進行后續(xù)試驗，整個試驗重復2 次及以上，直至2次試驗結果一致，RT-qPCR試驗詳細步驟參照TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒說明書。兩步法PCR 擴增反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復性30 s，40個循環(huán)。溶解曲線條件如下：95 ℃變性15 s，以0.3 ℃為步階從60 ℃升溫至95 ℃，95 ℃保溫15 s。利用一步法實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher 科技公司）檢測反應體系熒光變化，相對定量計算采用2－△△CT方法[13]。目的基因的引物設計和合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成，引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量反轉錄PCR擴增目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes by RT-qPCR

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和質控報告

采用Illumina HiSeqTM高通量測序技術對在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）條件下培養(yǎng)24 h的M.guilliermondii進行轉錄組測序，結果如表2 所示。經(jīng)測序質量控制，共獲得55.39 Gb 高質量堿基，各樣品堿基錯誤率接近于0，Q20 和Q30 堿基百分比均不小于93%，樣品各項檢測參數(shù)達到質量要求，適合之后的深度分析。

2.2 季也蒙畢赤酵母響應鹽脅迫的基因差異表達分析

為了探究M. guilliermondii 在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）培養(yǎng)條件下的差異表達基因，對樣品數(shù)據(jù)進行差異表達分析，篩選條件為：校正后的P值＜0.05且|log2（差異倍數(shù)）|＞1。結果如圖1所示：鹽脅迫組與非鹽脅迫組之間有1 027個顯著性差異表達基因，其中458個基因表達上調，569個基因表達下調。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質量情況統(tǒng)計Table 2 Statistics of data output quality

圖1 試驗組差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plot of the differential expression genes among test groups

2.3 差異表達基因的GO 功能注釋和富集分析

GO富集分析能夠了解差異表達基因與哪些生物學功能顯著相關，共涵蓋基因的分子功能（molecular function）、所在的細胞組分（cellular component）和參與的生物過程（biological process）等3 方面的內容。本研究將M. guilliermondii 在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）培養(yǎng)條件下篩選得到的差異基因采用GOseq方法[14]進行GO富集分析，并挑選富集最顯著的30 個GO 項繪制差異基因GO富集柱狀圖，結果如圖2所示：經(jīng)鹽脅迫后M.guilliermondii的差異表達基因主要富集在生物過程分類中，其中，代謝過程類別所占比例最大，其次為生物合成過程類別及單組織過程類別；在細胞組分分類中，細胞核部分所占比例最大；在分子功能分類中，離子結合及催化活性功能類別占比最大。由此可以得出，由于鹽脅迫培養(yǎng)，導致M.guilliermondii的核組裝、核苷酸代謝、糖代謝及輔酶代謝基因產(chǎn)生了較大差異，進而影響了細胞的分裂及代謝過程。

2.4 差異基因KEGG 富集分析

圖2 差異表達基因GO富集柱狀圖Fig.2 GO enrichment histogram of differential expression genes

KEGG 是有關基因通路的主要公共數(shù)據(jù)庫[15]。在生物體內，不同基因相互協(xié)調行使其生物學功能，通過通路（pathway）顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。本試驗差異基因的通路富集分析結果表明：差異表達基因分布在90個通路中，其中將富集最顯著的20條通路繪制差異基因KEGG富集散點圖，并通過富集因子、Q 值和富集到此通路上的基因個數(shù)來衡量富集程度，結果如圖3 所示。季也蒙畢赤酵母在鹽脅迫（12% NaCl）與非鹽脅迫（0% NaCl）培養(yǎng)條件下，KEGG代謝通路中顯著富集的有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，DNA復制，脂肪酸生物合成，減數(shù)分裂-酵母調控，半乳糖代謝，過氧化物酶體，甲烷代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，MAPK信號通路-酵母，苯丙氨酸代謝，氰基氨基酸代謝，細胞周期-酵母等信號通路。其中大部分富集通路都與細胞的分裂、代謝有關，且也有文獻證明MAPK 信號通路與生物受到逆境脅迫的應激反應相關[16-17]。

2.5 差異表達基因的RT-qPCR 驗證

本試驗隨機選取12個分別在MAPK信號通路-酵母中顯著變化的基因（STE12、RHOA、PBS2、GPD1、GRE2、FKS2、HOG1、BMH1, 2-YWHAE、SHO1、STE20-PAK1、WSC2、CSNKI）進行RT-qPCR分析以驗證轉錄組測序結果的可靠性，以Actin作為內參基因，驗證結果如圖4 所示。經(jīng)過鹽脅迫培養(yǎng)后，M.guilliermondii上述12個基因中有7個基因表達顯著上調，5 個基因表達顯著下調。RT-qPCR 定量分析顯示，RT-qPCR驗證結果與轉錄組測序結果中差異表達基因的變化趨勢一致，說明此次轉錄組測序的可信度很高。

3 討論與結論

本研究將M. guilliermondii 在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）條件下進行培養(yǎng)，并通過Illumina HiSeqTM高通量測序技術進行轉錄組測定。結果表明：鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）下培養(yǎng)的M.guilliermondii 相比共有1 027 個顯著性差異表達基因，其中458 個基因表達上調，569個基因表達下調。通過GO富集發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽脅迫處理后M.guilliermondii 的差異表達基因主要富集在生物過程分類中，其中核苷酸代謝、糖代謝及輔酶代謝基因產(chǎn)生較大差異。對差異基因進行KEGG富集分析，結果大部分富集通路都與細胞的分裂、代謝有關，與GO 富集結果相對應。推測可能是因為鹽脅迫促進了M.guilliermondii的生物代謝過程，提升了自身的復制與代謝效率，從而增強了M.guilliermondii 的抗逆性。MAPK 信號通路-酵母與酵母受到逆境脅迫的應激反應相關[18-20]，對隨機選取的MAPK 信號通路-酵母的12 個顯著上/下調表達基因進行RT-qPCR驗證，其結果與轉錄組測序結果趨于一致。以上轉錄組數(shù)據(jù)可以為鹽脅迫培養(yǎng)對M.guilliermondii 的生長影響及進一步的生物學探究提供科學依據(jù)。

圖3 差異表達基因的KEGG通路富集散點圖Fig.3 Enrichment scatter plot of differential expression genes’ KEGG pathway

圖4 基于實時熒光定量反轉錄PCR（RT-qPCR）的季也蒙畢赤酵母基因轉錄表達分析Fig.4 Transcriptional expression analysis of differential expression genes on M. guilliermondii detected by real-time quantitative reverse polymerase chain reaction(RT-qPCR)