陳婧，何宏燕,2*，劉昌勝,2

（1.華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海200237；2.華東理工大學(xué)教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，上海200237）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）作為一種功能性生長(zhǎng)因子，對(duì)于生命體的生長(zhǎng)發(fā)育，特別是骨再生修復(fù)有著非常重大的作用，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于骨組織修復(fù)工程領(lǐng)域[1-3]。在眾多BMP分子中，由基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2）在臨床上應(yīng)用較為廣泛。rhBMP-2 具有和人類天然BMP-2 相同的氨基酸序列，已被美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）和歐洲藥品評(píng)估局（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products,EMEA）批準(zhǔn)用于大段骨缺損、骨不連和脊柱融合等的臨床手術(shù)治療中。rhBMP-2不僅能夠規(guī)避異種因子存在的免疫反應(yīng)以及病原傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也避免了使用動(dòng)物組織來(lái)提取生長(zhǎng)因子導(dǎo)致的質(zhì)量問(wèn)題和純度問(wèn)題[4]。已有大量研究表明，將rhBMP-2以物理吸附、共價(jià)接枝、層層自組裝、仿生沉積或電化學(xué)沉積等方法添加到材料表面或內(nèi)部均會(huì)顯著提高植入材料在缺損部位的誘導(dǎo)成骨效果，其濃度的高低和活性的維持直接影響植入材料的成骨能力[5-9]。目前，評(píng)價(jià)rhBMP-2濃度和活性的方法主要包括二辛可寧酸（bicinchoninic acid,BCA）檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性檢測(cè)。其中：BCA 檢測(cè)方法雖然具有成本低、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)區(qū)間在20～2 000 μg/mL 之間，靈敏度較低，且缺乏特異性；ELISA 檢測(cè)雖然滿足了特異性和高靈敏度的要求，但操作相對(duì)復(fù)雜，試劑成本高；而ALP活性檢測(cè)可以直接衡量rhBMP-2的活性，但耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，反應(yīng)時(shí)間通常需3～7 d，尤其是評(píng)價(jià)由大腸埃希菌（Escherichia coli）表達(dá)系統(tǒng)制得的rhBMP-2濃度和活性更具挑戰(zhàn)。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、價(jià)廉、精準(zhǔn)的rhBMP-2檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

將微流控技術(shù)和特異性抗體-抗原反應(yīng)的免疫分析相結(jié)合，在玻璃或高分子芯片上刻痕，研制免疫分析微流芯片是酶聯(lián)免疫分析的主要發(fā)展趨勢(shì)[10-13]?？毯鄣玫降奈⒘鞯辣缺砻娣e大、體積小，不僅大大減少了抗體和試液的消耗，而且洗滌和孵育所需時(shí)間大大縮短，實(shí)現(xiàn)了快速免疫分析。但是，微流道檢測(cè)孔內(nèi)由于試劑用量的大大減少，也會(huì)使得檢測(cè)信號(hào)降低，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)之間的差異不易區(qū)分。因此，迫切需要對(duì)微流芯片檢測(cè)孔進(jìn)行改性，提高抗體的吸附效率，才可以保證足夠的線性檢測(cè)范圍和檢測(cè)靈敏度。等離子體處理是通過(guò)將氣體暴露在高頻振蕩區(qū)域，氣體的電子和原子核產(chǎn)生分裂，繼而形成等離子。使用該方法處理材料表面，極易引入羥基、氨基等活性官能團(tuán)，有效地提高材料的表面活性用于后續(xù)反應(yīng)[14-15]。蛋白A（protein A）來(lái)源于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁，在一定酸度下能夠維持其活性，且穩(wěn)定性非常好。已有研究表明，蛋白A 能夠強(qiáng)烈地與多種哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，即形成蛋白A-Fc結(jié)合，有效調(diào)節(jié)了抗體的特異吸附方向，在一定程度上有利于抗體進(jìn)一步結(jié)合抗原，進(jìn)而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度[16-17]。

本文結(jié)合酶聯(lián)免疫分析與微流控檢測(cè)策略，力求實(shí)現(xiàn)rhBMP-2的特異和精準(zhǔn)的濃度檢測(cè)。首先，以大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)制備的rhBMP-2為樣本，篩選出與其有特異性結(jié)合作用的抗體。其次，為了提高檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，基于調(diào)控抗體特異方向的策略，采用等離子體-蛋白A方法對(duì)高分子微流芯片的檢測(cè)孔進(jìn)行修飾（圖1），以評(píng)價(jià)抗體蛋白在微流芯片表面的吸附效果以及最終的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，探討微流控技術(shù)用于rhBMP-2濃度檢測(cè)的前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

過(guò) 氧 化 氫（H2O2）、3- 對(duì) 羥 基 苯 丙 酸（3-hydroxyphenylpropionic acid, HPPA）、脫鹽柱、封閉緩沖液、碳酸氫鈉粉末、磷酸鹽粉末、蛋白A、酪氨酸酶（25 KU）［購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司］；rhBMP-2第1抗體、rhBMP-2第2抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）共軛鏈霉素和聚氧乙烯基單月桂酸酯（Tween-20）（購(gòu)自上海欣博盛生物科技有限公司）。分別從上海潤(rùn)裕生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱“潤(rùn)裕”）、上海欣博盛生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱“欣博盛”）和美國(guó)派普泰克公司（簡(jiǎn)稱“派普泰克”）購(gòu)買BMP-2 ELISA 試劑盒和相關(guān)的抗體，其中，潤(rùn)?？贵w是小鼠單抗IgG（Abcam:ab6285）。rhBMP-2 標(biāo)準(zhǔn)品由合作單位上海瑞邦生物材料有限公司（簡(jiǎn)稱“瑞邦”）提供；芯片由中國(guó)臺(tái)灣Ritek公司提供，微流道深度均為200 μm。

1.2 rhBMP-2 抗體的篩選

首先，將市售的BMP標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋至1 000 pg/mL，瑞邦rhBMP-2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至相同質(zhì)量濃度。選用不同公司的試劑盒，每孔加入100μL 樣品，孵育90 min；棄去剩余試劑，每孔加入350μL洗滌液，靜置30 s后棄去液體，重復(fù)洗板5次。接著，每孔加入100μL 第2 抗體，孵育60 min；棄去剩余試劑，洗板5 次。然后，每孔加入100μL HRP，避光孵育30 min；棄去剩余試劑，洗板5 次。再接著，每孔加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine, TMB），避光孵育15 min。最后，每孔加入100 μL 終止液，3 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值。以上每次孵育時(shí)用封板膠紙封住反應(yīng)孔，孵育溫度為37 ℃。所得的數(shù)據(jù)依照式（1）分別計(jì)算不同ELISA試劑盒的η值；η值越接近1，表明標(biāo)樣抗體對(duì)E.coli-rhBMP-2的特異性吸附越好。

圖1 高分子微流芯片表面的等離子體-蛋白A處理工藝示意圖Fig.1 Schematic diagram of the plasma-protein A treatment process on the surface of polymer-based microfluidic chip

式中：D樣是瑞邦rhBMP-2 標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值；D標(biāo)是對(duì)應(yīng)的試劑盒中相同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3 抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

由于抗體初始質(zhì)量濃度不同，分別將潤(rùn)裕和派普泰克抗體采用超純水稀釋至25μg/mL；欣博盛抗體的質(zhì)量濃度為1μg/mL。用J-715 型圓二色譜儀（JASCO公司，日本）測(cè)定抗體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為190～260 nm，掃描步長(zhǎng)為1 nm，控溫20 ℃。采用CDNN 2.1軟件計(jì)算溶液中抗體蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的百分比。

1.4 等離子體-蛋白A 表面改性

將微流芯片分割為小塊（1 cm×1 cm），隨機(jī)分成2 組放入燒杯中，并加入一定量去離子水使其浸沒(méi)，超聲處理5 min，吹干表面后待用。調(diào)節(jié)氧氣流量，使壓力表指針?lè)€(wěn)定在0.3～0.4之間，在100 W功率下對(duì)所有樣品處理1 min，以清除樣品表面雜質(zhì)。然后，關(guān)閉氧氣通路開(kāi)關(guān)，抽真空，將腔體內(nèi)氧氣去除。最后，接通氨氣通路開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)流量閥，使壓力表指針?lè)€(wěn)定在0.3～0.4之間，等待2 min以充分置換處理室及管路中的殘余氣體。氨氣等離子體處理功率分別為25、50和100 W。

配制50 mmol/L磷酸二氫鉀溶液，并調(diào)節(jié)pH至6.5。將酪氨酸酶溶解于一定量磷酸二氫鉀溶液中，配制成2 mg/mL 的酪氨酸酶溶液。按每100μL 為一份分裝，保存于－20 ℃冰箱中，備用。將蛋白A溶解于一定量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）中，得到質(zhì)量濃度為100μg/mL的蛋白A 溶液，按每500μL 為一份分裝，保存于－20 ℃冰箱中，備用。取一份酪氨酸酶溶液（100μL）和一份蛋白A溶液（500μL），混合均勻，加入到經(jīng)等離子體活化后的樣品表面（每孔2μL），置于培養(yǎng)皿（空氣密封或濕潤(rùn)密封）中，在4 ℃條件下靜置4 h。

1.5 表面水接觸角測(cè)定

等離子體處理工藝參數(shù)對(duì)微流芯片親水和疏水特性的影響采用JC2000D2 型水接觸角測(cè)量?jī)x（上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司）進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)中每次所需純凈水體積約為3 μL，拍照記錄水滴與材料表面接觸瞬間的情況，并測(cè)量水滴與平面的接觸角，同等條件下測(cè)量3次，取平均值。

1.6 抗體的熒光染色

取市售的碳酸氫鈉粉末一份，溶解于50 mL 去離子水中，并調(diào)節(jié)pH 至0.9±0.1，得到碳酸氫鈉溶液。在異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer,FITC）中加入適量碳酸氫鈉溶液，配制成摩爾比為2.5∶1的FITC溶液。取市售的磷酸鹽粉末一份，溶解于1 000 mL去離子水中，并將pH調(diào)至7.4±0.1，得到磷酸鹽緩沖液（PBS）。取100μL 第1 抗體與50μL 2.5∶1 的FITC 溶液混合，于室溫條件下避光振蕩2 h，獲得抗體-FITC結(jié)合物。用PBS將凝膠過(guò)濾柱清洗2遍。將抗體-FITC結(jié)合物從凝膠過(guò)濾柱的上方加入，以去除未與抗體結(jié)合的FITC，收集過(guò)濾液，在4 ℃條件下避光保存。用PBS 洗出殘留在凝膠過(guò)濾柱中的FITC，在4 ℃條件下避光保存。

1.7 抗體的吸附效率

為了研究等離子體處理功率和濕潤(rùn)條件對(duì)第1抗體吸附效率情況的影響規(guī)律，樣品表面經(jīng)等離子體-蛋白A 處理后（氨氣等離子體處理時(shí)間為30 s,處理功率分別為25和100 W），多余液體被吸出，在檢測(cè)孔中加入PBS，洗滌3次。然后在檢測(cè)孔中加入2μL抗體-FITC，置于敞口表面皿（干燥環(huán)境）或帶蓋表面皿（內(nèi)部濕潤(rùn)環(huán)境）中，于4 ℃條件下孵育4 h，洗板3 次后，在A1R 型激光共聚焦顯微鏡（尼康公司，日本）下觀察微流芯片檢測(cè)孔內(nèi)熒光分布情況。

1.8 微流芯片表面在ELISA不同階段的特性表征

分別采用25 和100 W 等離子體功率處理樣品30 s，將第1 抗體、rhBMP-2 和第2 抗體依次特異吸附到樣品表面，通過(guò)EASCAB 250 XI型X射線光電子能譜儀（Themo Fisher 科技公司，美國(guó)）對(duì)表面進(jìn)行N 元素分析。通過(guò)X 射線光電子能譜技術(shù)（Xray photoelectron spectroscopy, XPS）及N（1s）分峰對(duì)比，可以判斷微流芯片表面N元素變化。將微流芯片切割成3 mm×3 mm 的樣品，在SPM 9500 型原子力顯微鏡（Shimadzu公司，日本）下觀測(cè)每個(gè)反應(yīng)階段樣品經(jīng)改性處理后的表面形貌，并采用NanoScope Analysis 1.5軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.9 微流芯片-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

根據(jù)1.4所述的方法對(duì)微流芯片檢測(cè)孔進(jìn)行表面改性，其中等離子體處理功率為100 W，時(shí)間為30 s。檢測(cè)孔表面吸附特異抗體后，根據(jù)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中自制rhBMP-2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為0、250、500、1 000、2 000 pg/mL。所用底物A、B 的配制方法如下。底物A：0.045 26 g HPPA粉末溶于11.3 mL Tris-HCl緩沖液中；底物B：10μL H2O2溶于11.3 mL Tris-HCl 緩沖液中。在DMi8 倒置熒光顯微鏡（徠卡公司，德國(guó)）下觀察微流芯片檢測(cè)孔內(nèi)的熒光強(qiáng)度，并用Image J 1.8.0 軟件計(jì)算孔內(nèi)平均光密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 第1 抗體的篩選

已有研究表明，基于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的rhBMP-2蛋白具有良好的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力，可以促進(jìn)C2C12 細(xì)胞向成骨方向分化[18]。因此，本文選用C2C12 細(xì)胞作為評(píng)價(jià)原核rhBMP-2 活性的細(xì)胞模型。不同質(zhì)量濃度的rhBMP-2 樣品在C2C12 細(xì)胞系中的ALP 活性表達(dá)情況如圖2A 所示：當(dāng)rhBMP-2 樣品質(zhì)量濃度低于156.25 ng/mL時(shí)，ALP 表達(dá)的吸光度值均在0.11 左右，說(shuō)明此時(shí)rhBMP-2 樣品并不能有效地誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞向成骨方向分化；隨著其質(zhì)量濃度的增大，ALP 的活性表達(dá)迅速增強(qiáng)，意味著rhBMP-2成骨分化能力迅速提升；當(dāng)rhBMP-2質(zhì)量濃度達(dá)到1 250.00 ng/mL時(shí)，吸光度值達(dá)到1.03；此后，隨著rhBMP-2質(zhì)量濃度的增大，吸光度值的增長(zhǎng)速率減緩且趨于平穩(wěn)，最終停留在1.60附近，說(shuō)明rhBMP-2已經(jīng)發(fā)揮出最佳效果，最大限度地誘導(dǎo)了C2C12細(xì)胞向成骨方向分化，其質(zhì)量濃度繼續(xù)增加對(duì)提高誘導(dǎo)能力的意義不大?？梢?jiàn)，在一定質(zhì)量濃度范圍（156.25～1 250.00 ng/mL）內(nèi)，rhBMP-2的骨誘導(dǎo)能力具有劑量依賴性。

選取1 000 pg/mL的自制rhBMP-2樣品，采用不同廠家的ELISA 試劑盒檢測(cè)其在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，然后計(jì)算其與不同廠家標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)值的比值（η值）。如圖2B所示，僅有欣博盛的η值接近于1，意味著測(cè)得的吸光度值接近于同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，也間接證明上海欣博盛公司的ELISA抗體可用于大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的rhBMP-2特異性吸附。而另外2家極低的η值表明，它們的抗體無(wú)法有效地捕獲大腸埃希菌系統(tǒng)生產(chǎn)的rhBMP-2蛋白，原因可能與不同抗體的結(jié)構(gòu)和特性不同有關(guān)。

將圓二色譜圖經(jīng)CDNN 2.1 軟件解析，得到不同廠家第1 抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件含量。如表1 所示：潤(rùn)裕抗體和欣博盛抗體的結(jié)構(gòu)較相似，98%以上的結(jié)構(gòu)均為螺旋構(gòu)型，其余為少量的β-折疊構(gòu)型。其中潤(rùn)裕抗體的結(jié)構(gòu)略復(fù)雜一些，還含有少量的正向平行構(gòu)型和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)型。而派普泰克抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，無(wú)規(guī)卷曲的成分最多，達(dá)到45.0%，其余成分則由螺旋、反向平行、正向平行和β-折疊構(gòu)型構(gòu)成?；诖?，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)和比較均選用欣博盛抗體。

圖2 瑞邦自制rhBMP-2 的堿性磷酸酶（ALP）活性（A）和用不同廠家試劑盒檢測(cè)的η值（B）Fig.2 Alkaline phosphatase (ALP) activity of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) with different concentrations (A) and η value calculated by the measured data from different enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)kits(B)

2.2 微流芯片表面的親疏水特性

表1 不同抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件含量比較Table 1 Comparison of the secondary structure contents of different antibodies %

圖3 不同等離子體處理功率下微流芯片表面的接觸角對(duì)比Fig.3 Comparison of contact angles on the microfluidic chip surfaces treated with different plasma powers

能是由于等離子體在材料表面除了引入親水基團(tuán)外，還會(huì)對(duì)表面進(jìn)行刻蝕作用，功率越大導(dǎo)致刻蝕程度越高，表面越粗糙，進(jìn)而使得接觸角增大。

2.3 第1 抗體吸附情況的比較

圖4比較了不同等離子體功率處理后的表面對(duì)第1 抗體的吸附效果?？梢钥闯觯涸谖纯刂茲穸鹊母稍锃h(huán)境中，未處理表面和實(shí)驗(yàn)組表面的熒光強(qiáng)度都非常弱，很難分辨出檢測(cè)區(qū)的邊界，僅在檢測(cè)孔內(nèi)有少許分散的熒光點(diǎn)，但由于這些熒光點(diǎn)分散不均且數(shù)量太少，因此，無(wú)法根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化等離子體處理的功率和處理時(shí)間。這與試劑用量過(guò)少（2μL）有關(guān)，在沒(méi)有調(diào)控濕度的情況下溶劑非常容易揮發(fā)，使得孵育過(guò)程中因試劑的揮發(fā)而提前終止。在表面皿內(nèi)添加濕紙巾以控制濕度的環(huán)境中，未處理表面的熒光強(qiáng)度仍然很弱，但是實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度明顯優(yōu)于未處理表面，能夠清晰地分辨出檢測(cè)孔的邊界。這意味著等離子體處理可以增強(qiáng)第1抗體在表面的吸附。同時(shí)也說(shuō)明在濕潤(rùn)情況下，可以有效地緩解試劑的揮發(fā)，保證孵育時(shí)間，使得實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。隨著處理功率的增大，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即吸附在表面的抗體逐漸增多，其中，處理功率100 W、處理時(shí)間30 s時(shí)第1抗體的吸附效果最好。

2.4 微流芯片表面在ELISA 不同反應(yīng)階段的特性比較

圖4 干燥和濕潤(rùn)情況下不同微流芯片表面對(duì)第1抗體的吸附效果比較Fig.4 Comparison of the first antibody absorption on the microfluidic chip surfaces treated with different plasma powers under dry and humid conditions

圖5 微流芯片表面在ELISA的不同反應(yīng)階段的表面形貌比較Fig.5 Comparison of surface morphologies of microfluidic chip at different ELISA stages

圖5比較了微流芯片表面在ELISA不同反應(yīng)階段的原子力顯微鏡圖像?？梢钥闯觯何刺幚淼膶?duì)照組表面具有平行但間距及深度不勻的溝壑；處理功率為25 W時(shí)，處理后的表面變?yōu)椴灰?guī)則的突起，存在一定的刻蝕作用，隨著第1抗體和rhBMP-2的特異吸附，表面突起漸漸變得不太尖銳；處理功率為100 W時(shí)，表面的溝槽和突起更為明顯，表面粗糙度更高，證實(shí)了這種功率處理下表面親水性較差。橫向比較的結(jié)果也表明，每個(gè)反應(yīng)階段的表面粗糙度均發(fā)生了明顯變化，間接證實(shí)了不同階段反應(yīng)在表面的順利進(jìn)行。

圖6比較了ELISA不同反應(yīng)階段微流芯片表面含N 量的變化。可以看出：未處理微流芯片表面（CK）不含有N元素；如N1曲線所示，等離子體處理后，樣品表面帶有氨基，N元素增加；如N2曲線所示，N元素含量再次增加，證明第1抗體成功地特異吸附到微流芯片表面；N3曲線中N元素的強(qiáng)度增加顯著，證實(shí)了rhBMP-2分子也成功地連接到樣品表面。

2.5 采用微流芯片-ELISA 測(cè)定的rhBMP-2 的質(zhì)量濃度曲線

圖6 微流芯片表面在ELISA不同反應(yīng)階段的元素表征比較Fig.6 Characterization comparison of surface elements of microfluidic chip at different ELISA stages

圖7 展示了不同質(zhì)量濃度rhBMP-2 在微流芯片檢測(cè)孔表面的ELISA熒光顯色情況?？梢钥闯觯寒?dāng)rhBMP-2 的質(zhì)量濃度為0 pg/mL 時(shí)，檢測(cè)區(qū)內(nèi)的熒光強(qiáng)度非常低；隨著rhBMP-2 質(zhì)量濃度的增大，檢測(cè)區(qū)的顏色愈加明亮，檢測(cè)區(qū)內(nèi)外差異愈加明顯，意味著微流芯片檢測(cè)孔內(nèi)的ELISA熒光強(qiáng)度與體系中rhBMP-2的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。

使用Image J 1.8.0軟件對(duì)圖片的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，計(jì)算出孔內(nèi)的平均光密度，并使用ELISA Calc軟件將濃度與平均光密度的關(guān)系作線性擬合。如圖8所示：改性微流芯片孔內(nèi)平均光密度與rhBMP-2的質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，線性擬合的R2值為0.993，線性區(qū)間為0～2 000 pg/mL；與之不同的是，采用欣博盛的96孔板，rhBMP-2的線性區(qū)間為0～250 pg/mL。

2.6 微流芯片-ELISA 與傳統(tǒng)ELISA 對(duì)比

由表2可知，與傳統(tǒng)ELISA相比，所制得的微流芯片-ELISA 試劑用量約為傳統(tǒng)試劑用量的2.7%，顯著減少了試劑用量和成本。

3 結(jié)論

如前所述，市售ELISA試劑盒雖然具有良好的敏感性和特異性，但時(shí)間成本和試劑成本較高。本文將微流控檢測(cè)技術(shù)與ELISA相結(jié)合，在保持ELISA高敏感性和特異性的情況下，還具有以下優(yōu)點(diǎn)。

1）抗體蛋白的吸附效率與材料表面的親水性、粗糙度等有著緊密關(guān)系：氨氣等離子體處理功率較大時(shí)（100 W），親水性較差，但表面粗糙度較大，表面積增大，抗體的吸附效率反而增大。

圖7 改性微流芯片對(duì)不同質(zhì)量濃度rhBMP-2的ELISA熒光顯色對(duì)比Fig.7 Fluorescence comparison of rhBMP-2 with different concentrations using modified microfluidic chip

圖8 改性微流芯片（A）和欣博盛96孔板（B）的rhBMP-2 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比Fig.8 Comparison of standard ELISA curves of rhBMP-2 using the modified microfluidic chip(A)and the standard 96-well plate(B)

表2 微流芯片-ELISA與傳統(tǒng)ELISA試劑用量對(duì)比Table 2 Comparison of the reagent consumption using microfluidic chip-ELISA and traditional ELISA kits μL

2）采用100 W、30 s 氨氣等離子體處理微流芯片表面后，可以有效地檢測(cè)出rhBMP-2 質(zhì)量濃度。相比傳統(tǒng)96孔ELISA法的試劑用量600 μL/樣品和線性區(qū)間0～250 pg/mL，微流芯片-ELISA 方法使試劑用量減少約97.3%，而其線性范圍卻拓展為0～2 000 pg/mL。

綜上所述，等離子體-蛋白A 的靶向修飾通過(guò)調(diào)控抗體的特異吸附方向顯著提高了rhBMP-2 抗體的吸附效率，拓展了線性檢測(cè)范圍，降低了試劑成本。該修飾技術(shù)同樣適用于目前ELISA 檢測(cè)所涉及的眾多領(lǐng)域，在醫(yī)療診斷、食品安全及環(huán)境檢測(cè)等中具有廣泛的應(yīng)用潛力。