王小秋 杜海波 陳夕軍 李明友 王嘉楠 許志文 馮志明, 陳宗祥,左示敏,,

(1 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2 揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；*通信聯(lián)系人，E-mail: smzuo@yzu.edu.cn)

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的真菌性病害，是全世界范圍內(nèi)影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一，發(fā)病時(shí)會造成糧食損失，嚴(yán)重時(shí)甚至顆粒無收[1]，被稱作水稻的“癌癥”[2]。根據(jù)危害時(shí)期和部位，稻瘟病可分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟和穗頸瘟等，其中又以穗頸瘟對水稻生產(chǎn)的威脅最大[3]。穗頸瘟發(fā)生在水稻穗頸（穗軸與稻穗連接部位），一般在水稻抽穗破口前感染，在始穗后稻瘟菌侵入其中進(jìn)行繁殖和危害，導(dǎo)致穗頸節(jié)壞死，阻斷輸送到穗的養(yǎng)分通道，形成癟?；虬姿?，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量，甚至?xí)斐山^收[4]。目前對于稻瘟病的防控主要依賴化學(xué)藥劑和選育抗病品種。相比于化學(xué)防治的諸多缺點(diǎn)[5]，培育和推廣抗病品種無疑是防治稻瘟病流行最經(jīng)濟(jì)安全和綠色高效的方法[6]。

定位克隆抗稻瘟病基因是開展抗病育種的重要前期工作。迄今已報(bào)道的稻瘟病質(zhì)量抗性基因（resistance gene，R基因）有100 余個(gè)，數(shù)量性狀基因（quantitative trait loci, QTL）500 余個(gè)，已克隆的R 基因有近27 個(gè)[7-8]，多數(shù)分布在水稻第1、6和11 染色體上的幾個(gè)座位[9]。通過相關(guān)基因的功能標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)Pita、Pb1、Pia、Pik、Pi-kh、Pish等基因在江蘇粳稻品種中各有不同程度的分布，相反，Pi9/2座位中的不同廣譜抗性基因在江蘇粳稻品種中基本不存在[10-11]。李剛等[12]對江蘇省554 份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行抗稻瘟病基因分子檢測，發(fā)現(xiàn)攜帶Pita、Pib和Pik基因的材料都達(dá)到了30%及以上，其中Pik所占比例達(dá)到了82.2%。朱勇良等[13]認(rèn)為以Pita為代表的一些抗性基因?qū)K粳稻的穗頸瘟抗性正在逐漸喪失，但王軍等[14]對2007-2013 年江蘇省審定的粳稻品種的穗頸瘟抗性研究表明，攜帶Pita、Pib和Pikm的材料穗頸瘟抗性總體較好。總體而言，在以上這些研究中大多缺少了對基因互作效應(yīng)的分析。有研究表明，通過聚合多基因來改良品種抗病性時(shí)，需要選擇合適的基因組合，從而使聚合的抗病基因間能有效互補(bǔ)甚至產(chǎn)生增效作用，達(dá)到增強(qiáng)抗性、拓寬抗譜的目的[15]。陳羽等[16]在揚(yáng)稻6 號背景下，構(gòu)建了Pigm、Pi40、Pi9、Pi2和Piz中的不同基因分別與Pi1、Pi33、Pi54間的兩兩聚合系，發(fā)現(xiàn)不同聚合系之間的抗性存在明顯差異，表明不同抗病基因間的互作機(jī)制可能廣泛存在，并最終影響聚合效果。相比同一背景下特定地研究某些基因之間的互作效應(yīng)，在復(fù)雜遺傳背景下評估分析不同基因間的聚合效應(yīng)更符合育種實(shí)際，但目前還少有相關(guān)的研究報(bào)道。

水稻是江蘇優(yōu)勢農(nóng)作物，單產(chǎn)位于全國前列，總產(chǎn)占全國的10%左右。江蘇水稻以粳稻為主，種植面積占總面積的85%以上，因此，研究分析江蘇粳稻品種在已知稻瘟病抗性基因位點(diǎn)上的基因型信息并分析其對穗頸瘟的抗性貢獻(xiàn)，具有十分重要的意義。利用14 個(gè)抗病基因的功能標(biāo)記，本研究對江蘇近年育成的195 份粳稻新品種/系在相關(guān)位點(diǎn)上的基因型信息進(jìn)行分析；同時(shí)，通過6 個(gè)稻瘟菌小種混合接種，對其中的158 個(gè)品種以及17 份攜帶Pigm基因的回交株系進(jìn)行穗頸瘟抗性鑒定；最后，通過邏輯回歸，評估了對穗頸瘟抗性有顯著貢獻(xiàn)的基因和基因組合。該結(jié)果有利于指導(dǎo)江蘇粳稻抗穗頸瘟育種實(shí)踐，也可為同類研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

用于稻瘟病抗病基因分析的水稻品種/系共209份，包括江蘇省2013-2019 年審定的粳稻品種66份，2013 年前審定但在2019 年江蘇水稻生產(chǎn)上仍有一定推廣面積的粳稻品種22 份，2019 年參加江蘇省區(qū)域試驗(yàn)的粳稻新品種/系107 份，以及14 份攜帶已知稻瘟病基因抗、感病等位基因的陽、陰性對照品種。各材料具體見附表1 和表1，其中麗江新團(tuán)黑谷（LTH）背景下的相關(guān)抗病基因單基因系由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院王艷麗老師實(shí)驗(yàn)室惠贈。

用于穗頸瘟接種鑒定的材料有175 份，包括上述材料中的158 份和本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的攜帶抗稻瘟病基因Pigm的回交高世代株系17 份?；亟桓呤来晗稻唧w為粳稻品種淮稻119 背景下的BC6F3株系13份和武運(yùn)粳32 背景下的BC4F3 株系4 份。

1.2 菌株培養(yǎng)及接種鑒定

穗頸瘟抗性鑒定菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉永峰研究員實(shí)驗(yàn)室提供，為2018年江蘇不同地區(qū)病樣材料中分離到的6 個(gè)代表性菌株2019-16-3、2019-522、2019-578、2019-746、2019-863 和2019-942。將供試菌株移植到稻稈玉米粉培養(yǎng)基（玉米粉40 g、稻稈粉50 g、瓊脂20 g）上，在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d，之后用滅菌載玻片刮去培養(yǎng)基表面菌絲，在26℃黑光燈下照射72 h，待稻瘟病菌產(chǎn)生孢子后，用無菌水洗下，將各稻瘟病菌株孢子等比例混合，配成10×10 倍顯微鏡下每視野30～40 個(gè)孢子的懸浮液[17]。接種材料于2019 年5 月15 日播于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田，于6 月14 日移栽，單本栽插，每區(qū)2 行，每行12株，常規(guī)水肥管理。

表1 本研究用于各抗病基因檢測的陰陽性對照Table 1.Information of controls used in detection of resistance genes to blast disease in present study.

在水稻孕穗初期采用混合菌株進(jìn)行接種，用注射器將接種液緩緩注入稻苞內(nèi)，每小區(qū)接種5 株，每株接種1 個(gè)幼穗，每穗注射1 mL 孢子懸浮液。根據(jù)供試材料的生育期差異，分別于8 月14 日、20 日和27 日進(jìn)行接種。接種后于水稻蠟熟期，按農(nóng)業(yè)部發(fā)布的水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評價(jià)技術(shù)規(guī)程中“水稻穗頸瘟單穗損失率0～9 級分級標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行病情調(diào)查[18]。在品種最終病級判定上，若5 個(gè)接種穗的病級級別間小于2 個(gè)分級差異時(shí)，則取最高病級；病級種類不小于3 個(gè)分級差異時(shí)，若高病級占多數(shù)，取最高病級；若低病級占多數(shù)，取最高病級的下一級為該品種的最終病級。

1.3 抗病或感病等位基因的功能標(biāo)記

根據(jù)前人的研究報(bào)道，本研究對Pit、Pib、Pigm、Pid3、Pi25、Pid2、Pi3/5/i、Pia、Pik、Pikh、Pikm、Pi1、Pb1和Pita這14 個(gè)抗稻瘟病基因座位上的抗病和感病等位基因進(jìn)行檢測分析，采用的相關(guān)功能標(biāo)記引物見表2。其中Pik功能標(biāo)記為原菲律賓國際水稻研究所周波研究員團(tuán)隊(duì)惠贈。引物由北京擎科生物有限公司（南京）合成。

1.4 DNA 提取及PCR 檢測

采用CTAB 法提取DNA。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20 μL，包括模板DNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×Taq混合液(含染料)10 μL，滅菌雙蒸餾水7.2 μL。PCR 程序如下：95℃下預(yù)變性5 min，94℃下變性30 s，55℃～60℃下（視不同引物而定）退火30 s，72℃下延伸30～72 s（視不同片段大小而定），共35 個(gè)循環(huán)；72℃下再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物直接通過1%或4%（根據(jù)產(chǎn)物片段大小而定）瓊脂糖凝膠（EB 染色）電泳分離，然后在紫外凝膠成像儀上觀察并拍照或聚丙烯酰胺凝膠電泳成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用常用辦公軟件Excel 2016 對研究中獲得的各類數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖。對品種攜帶的抗病基因數(shù)和穗頸瘟抗性間的相關(guān)分析，采用 SPSS 16.0.0.247 統(tǒng)計(jì)分析軟件中的回歸分析模型進(jìn)行。對于中抗以上和中感以下兩類品種間攜帶的抗病基因數(shù)比較，以及對攜帶不同基因或基因組合的品種間病級差異分析，均采用SPSS 16.0.0.247 統(tǒng)計(jì)分析軟件中的常用方差分析（ANOVA）和t測驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢測。

采用SPSS 16.0.0.247 統(tǒng)計(jì)分析軟件中的邏輯（logistic）回歸模型[19]，分析不同基因?qū)λ腩i瘟抗性的貢獻(xiàn)。首先根據(jù)江蘇水稻新品種審定過程中對稻瘟病抗性級別要求不低于5 級的標(biāo)準(zhǔn)將供試品種表型重新劃分為兩個(gè)等級，即病級大于5 級的定義為1，小于等于5 級的定義為2 級；其次，分別采用單基因逐一邏輯回歸和多基因邏輯回歸，獲得各基因與抗性間的回歸系數(shù)（B）、顯著性P值、95%CI（confidence interval）值、優(yōu)勢比（odds ratio，OR，即Exp B）；最后，根據(jù)P值確定基因的效應(yīng)是否達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著水平，進(jìn)而根據(jù)OR 值判斷基因的效應(yīng)，相關(guān)結(jié)果采用森林圖進(jìn)行展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病基因功能標(biāo)記的擴(kuò)增驗(yàn)證

為了驗(yàn)證各抗稻瘟病基因功能標(biāo)記的PCR 擴(kuò)增結(jié)果是否與預(yù)期一致，利用14 個(gè)稻瘟病抗性基因的功能標(biāo)記，分別對已知或已報(bào)道的攜帶相應(yīng)抗病基因的供體（含抗病單基因系）和未攜帶相應(yīng)抗病基因的陰性對照進(jìn)行PCR 檢測，同時(shí)隨機(jī)檢測10 個(gè)江蘇粳稻品種。結(jié)果顯示（圖1），采用一對引物或單標(biāo)記即可區(qū)分抗、感等位基因的9 個(gè)抗病基因，在具有相應(yīng)抗病基因陽性對照中均能擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的片段，而在陰性對照中均未擴(kuò)增出或擴(kuò)增出與攜帶感病等位基因預(yù)期大小的片段；對于Pit基因，采用3 條引物（tRn1、tRn2 和tN11）同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí)，在陽性對照中分別出現(xiàn)733 bp 和530 bp 兩個(gè)片段，而在陰性對照中沒有擴(kuò)增條帶，與理論預(yù)期一致；對于Pigm基因，在陽性對照中擴(kuò)增出兩條帶，一條為內(nèi)參標(biāo)記Actin1-1的擴(kuò)增片段，另一條為Pigm基因特異標(biāo)記GMR-3 的擴(kuò)增片段，而在陰性對照上只有Actin1-1標(biāo)記的擴(kuò)增片段，與預(yù)期一致；對于Pib和Pita，在抗病對照中均只有采用抗病基因功能標(biāo)記才能擴(kuò)增出預(yù)期片段，而在陰性對照中也只能采用感病基因特異標(biāo)記才能擴(kuò)增出預(yù)期片段；對于Pikm基因，因其座位上存在兩個(gè)相互作用才能發(fā)揮抗病功能的基因Pikm1-TS和Pikm2-TS，因此需要兩對標(biāo)記進(jìn)行檢測，只有同時(shí)檢測到兩個(gè)基因預(yù)期片段大小的材料才能被認(rèn)為攜有Pikm，結(jié)果顯示兩個(gè)標(biāo)記在陽性和陰性對照上的擴(kuò)增結(jié)果也與預(yù)期結(jié)果一致。隨機(jī)選擇的10 個(gè)粳稻品種用不同基因標(biāo)記擴(kuò)增呈現(xiàn)不同結(jié)果，表明品種間攜帶的抗、感等位基因的不同。以上結(jié)果說明，本研究采用的各抗病基因功能標(biāo)記可以用于評價(jià)后續(xù)江蘇粳稻品種中攜帶的相關(guān)抗病基因信息。

表2 本研究用于各抗病基因檢測的功能標(biāo)記引物信息Table 2.Information of molecular markers used in detection of resistant genes to blast disease in present study.

2.2 各抗病基因在江蘇粳稻品種/系中的應(yīng)用情況

利用各功能標(biāo)記對供試的江蘇粳稻品種/系進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示（圖2-A），所有材料均不帶有抗病基因Pigm，其余13 個(gè)抗病基因則有不同程度的分布；Pi25與Pit出現(xiàn)頻率較低，分別為3%和6%；大部分的基因出現(xiàn)頻率為10%～30%，在50%左右的有2 個(gè)，為Pikh和Pita；Pib基因出現(xiàn)頻率最高，達(dá)到72%，即有141 份材料檢測到含有Pib。就品種而言，多數(shù)品種攜帶的基因數(shù)為2～5 個(gè)，有20 個(gè)品種各只攜帶1 個(gè)基因，有6 個(gè)品種攜帶7 個(gè)以上基因且其中1 個(gè)品種W046 攜帶抗病基因數(shù)達(dá)到9 個(gè)，為供試品種中攜帶抗稻瘟病基因數(shù)目最多的品種（圖2-B）。以上結(jié)果表明，江蘇粳稻品種在攜帶的已知抗稻瘟病基因上存在明顯差異，Pikh、Pita和Pib總體應(yīng)用較廣，且又以Pib的應(yīng)用最廣。

檢測的供試粳稻品種包括中熟晚粳、早熟晚粳、遲熟中粳和中熟中粳四種生態(tài)類型。為了分析不同生態(tài)類型品種間攜帶的抗病基因是否存在差異，對各基因在供試材料中的分布頻率進(jìn)行比較。由于中熟晚粳稻生態(tài)區(qū)較小且供試的品種數(shù)只有5 份，因此將其與早熟晚粳合并分析。結(jié)果顯示（圖3），大多數(shù)基因在三種生態(tài)類型間的出現(xiàn)頻率相近，少數(shù)基因存在明顯差異，如Pit和Pi3/5/i基因。Pit基因的檢出頻率總體較低，但更多分布在中熟中粳中，且在遲熟中粳中未檢測到該基因。Pi3/5/i基因在中熟中粳中的出現(xiàn)頻率是其在另兩類品種中的近4 倍。此外，有少數(shù)基因在不同品種類型間存在較小的分布差異，如Pid2、Pik較多存在于早/中熟晚粳中，Pid3較多存在于遲熟中粳中，Pia則較多在早/中熟晚粳和中熟中粳中。結(jié)果表明，多數(shù)抗病基因在不同生態(tài)型品種育種中得到了較為相近的應(yīng)用，僅有少數(shù)基因在不同生態(tài)類型品種間存在分布差異。

圖1 各抗病基因功能標(biāo)記在陽性、陰性等品種/系上的擴(kuò)增驗(yàn)證Fig.1.Validation of the molecular markers in determining the corresponding resistance gene using known positive and negative varieties or lines as well as 10japonica varieties randomly selected from Jiangsu Province.

圖2 各抗病基因在江蘇粳稻品種中的分布頻率（A）及品種攜帶不同抗病基因數(shù)分布（B）Fig.2.Distribution frequency of resistance genes injaponica rice from Jiangsu Province(A) and the distribution of gene number carried by varieties(B).

圖3 抗病基因在江蘇不同生態(tài)型粳稻品種中的分布頻率Fig.3.Distribution of resistance genes in different types ofjaponica rice.

由于供試品種/系涉及已經(jīng)審定（以下簡稱審定）和正在參加江蘇省新品種區(qū)域試驗(yàn)（以下簡稱區(qū)試）的兩大類型材料，因此，進(jìn)一步比較各基因在審定和區(qū)試品種間出現(xiàn)的頻率差異。結(jié)果顯示（圖4），Pid3、Pid2、Pia、Pb1這4 個(gè)基因在區(qū)試品種/系中的占比明顯高于其在審定品種中的占比，頻率差異在14%至23%之間；Pik、Pikh、Pi1和Pita在區(qū)試中的頻率同樣高于審定品種中，但差值均不足12%；其他基因的分布頻率在兩類品種間基本接近?？傮w而言，這些抗性基因在區(qū)試品種中的應(yīng)用頻率要高于審定品種。

2.3 供試品種穗頸瘟抗性分析

圖4 各抗病基因在2019 年前審定及2019 年區(qū)試品種/系間的頻率分布比較Fig.4.Comparison of resistance gene distribution frequency between varieties authorized before 2019 and regional test varieties in 2019.

為了盡可能排除生育期差異較大影響人工接種鑒定結(jié)果，本研究選擇了接種時(shí)生育進(jìn)程盡可能一致的分蘗穗進(jìn)行接種，最終進(jìn)行穗頸瘟人工接種鑒定的材料有158 份，其中早熟晚粳47 份、中熟晚粳5 份、中熟中粳47 份、遲熟中粳59 份。結(jié)果顯示（圖5-A），158 份供試品種中，病級在7 級或以上的品種達(dá)到了72%，達(dá)到中抗（病級為3 級）、抗?。ú〖墳? 級）及高抗（病級為0）的材料也只有35 份。各種生態(tài)類型中的抗感品種分布總體與總供試品種中的抗病分布趨勢相同，但中熟中粳類型中達(dá)到中抗以上品種/系的比例明顯高于另兩種生態(tài)類型，中熟中粳與早/中熟晚粳類型品種中的抗和高抗病品種比例相當(dāng)。進(jìn)一步比較了2019 年前審定品種和2019 年區(qū)試品種中病級小于等于5級的品種比例（圖5-B），結(jié)果顯示，區(qū)試品種中小于等于5 級的品種比例（42.9%）明顯高于審定品種中的比例（14.8%）。以上結(jié)果表明江蘇粳稻品種的穗頸瘟抗性總體較弱，區(qū)試中的新品種抗性水平總體好于已審定的推廣品種。

2.4 品種攜帶的抗病基因數(shù)與穗頸瘟抗性相關(guān)分析

圖5 供試品種稻瘟病病級分布Fig.5.Distribution of disease grade in varieties tested.

圖6 品種攜帶抗病基因數(shù)與病級間的關(guān)系分析Fig.6.Analysis of the resistance gene number carried by each variety and disease grade.

對供試品種分別攜帶的抗病基因數(shù)與穗頸瘟抗性病級進(jìn)行回歸分析，發(fā)現(xiàn)攜帶的抗病基因數(shù)多少與穗頸瘟抗性強(qiáng)弱間的決定系數(shù)R2為0.2128，未達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著水平（P值為0.357），表明兩者相關(guān)不顯著（圖6-A）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)比較病級≤3 的中抗以上品種和病級≥5 的中感以上品種間攜帶的抗性基因數(shù)差異（圖6-B），發(fā)現(xiàn)兩類品種攜帶的平均抗性基因數(shù)分別為3.7 和3.3，差異不顯著。在供試品種中，發(fā)現(xiàn)有品種僅攜帶少數(shù)幾個(gè)基因但卻表現(xiàn)較強(qiáng)的穗頸瘟抗性，如寧5916，只攜帶Pia和Pita兩個(gè)基因，接種鑒定為高抗；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)攜帶抗性基因數(shù)較多卻表現(xiàn)出高感的品種。以上結(jié)果表明，在抗稻瘟病育種中，不能簡單地通過增加基因數(shù)來實(shí)現(xiàn)品種的抗性改良。

2.5 優(yōu)異抗病基因和基因組合分析

為分析哪個(gè)/些基因?qū)Ρ敬位旌闲》N有較好的抗性，首先采用單基因邏輯回歸方法評估了各基因?qū)剐缘呢暙I(xiàn)，結(jié)果顯示（圖7-A），只有Pia和Pi3/5/i兩個(gè)基因與抗性間的回歸系數(shù)分別達(dá)到極顯著相關(guān)，回歸系數(shù)分別為2.20（P=0.000）和1.19（P=0.017），說明在單基因水平上其他基因?qū)剐跃鶡o顯著貢獻(xiàn)；進(jìn)一步計(jì)算得出Pia的Odds ratio(OR)值最高，為9.01，表明攜帶該基因?qū)剐缘呢暙I(xiàn)是不帶該基因的9 倍；其次為Pi3/5/i，其OR值為3.30。考慮到基因之間可能廣泛存在互作效應(yīng)，進(jìn)一步采用多基因邏輯回歸方法評價(jià)了各基因?qū)剐缘呢暙I(xiàn)，結(jié)果顯示（圖7-B），除了Pia和Pi3/5/i外，Pita基因?qū)剐缘呢暙I(xiàn)同樣達(dá)到了極顯著水平，而其他10 個(gè)基因均未達(dá)到顯著相關(guān)，表明他們存在與否對品種的抗性無影響；結(jié)合OR 值，可知三個(gè)顯著相關(guān)的基因貢獻(xiàn)率從高至低依次為Pia（OR=28.42）、Pi3/Pi5/Pii（OR=16.02）和Pita（OR=7.49）。

圖7 各抗病基因?qū)λ腩i瘟抗性的貢獻(xiàn)邏輯回歸統(tǒng)計(jì)參數(shù)Fig.7.Logistic regression statistical analysis about the contribution of each resistance genes to neck blast resistance.

相比單基因邏輯回歸結(jié)果，多基因分析中增加了一個(gè)對抗性顯著貢獻(xiàn)的基因Pita，暗示Pita基因可能通過與另兩個(gè)基因間的互作提供抗性。為此，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)比較Pia、Pi3/5/i和Pita這3 個(gè)基因不同組合方式間的品種病級差異。由于供試品種中未發(fā)現(xiàn)3 基因聚合的品種，同時(shí)Pia+Pi3/5/i雙基因聚合品種的樣本數(shù)也只有2 個(gè)，因此，這兩種組合未進(jìn)入比較分析。結(jié)果顯示（圖8），與3 個(gè)基因均不帶的對照品種平均病級（7.77）相比，攜帶Pi3/5/i（5.46）和Pia（5.94）中任一個(gè)基因的品種平均病級均得到了顯著降低，但兩者之間差異不顯著，而僅攜帶Pita單基因的品種病級與對照差異不顯著；就基因組合而言，發(fā)現(xiàn)攜帶Pi3/5/i+Pita雙基因的品種病級（3.00）顯著低于Pi3/5/i和Pia單基因品種病級，但又顯著高于攜帶Pia+Pita雙基因的品種（0.38），說明盡管Pita基因單獨(dú)存在時(shí)的抗性效應(yīng)不明顯，但在與另兩個(gè)基因聚合時(shí)，則可顯著增強(qiáng)另兩個(gè)基因的抗病效應(yīng)，且Pia與Pita間的聚合效應(yīng)顯著高于Pi3/5/i+Pita。隨后，發(fā)現(xiàn)在供試的158 份品種中，所有攜帶Pia+Pita雙基因的13 個(gè)品種其病級均為0 級或1 級。

以上結(jié)果表明，在單基因狀態(tài)下Pi3/5/i和Pia可顯著提升供試品種的穗頸瘟抗性，但抗性效應(yīng)不如其分別與Pita聚合的效應(yīng)，聚合狀態(tài)下又以Pia+Pita間的聚合效果最好，利用該基因組合有望顯著提升江蘇粳稻品種的穗頸瘟抗性。

2.6 攜帶Pigm 基因回交株系的穗頸瘟抗性分析

由于在供試材料中未檢測到攜帶Pigm基因的品種，因此本研究分別利用 HD119 和武運(yùn)粳32(WYJ32)背景中導(dǎo)入Pigm的回交株系為材料，對Pigm基因的抗病效果進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示（圖9-A、B）：對照HD119 的抗性級別為7 級，為感病水平，而其背景下的13 個(gè)攜帶Pigm的高世代回交株系的抗性水平均達(dá)到中抗及以上，其中10 份病級均為0，達(dá)到了高抗水平；對照WYJ32 表現(xiàn)為高感穗頸瘟，在其背景下導(dǎo)入Pigm的4 份高世代回交株系中，有2 份分別達(dá)到抗和高抗水平。這表明利用Pigm基因可顯著提高江蘇粳稻品種的穗頸瘟抗性。

圖8 三個(gè)對穗頸瘟抗性有顯著貢獻(xiàn)的基因及組合間的品種病級差異比較Fig.8.Contribute significantly of three genes to the resistance of neck blast resistance and the comparison of disease grade differences among them and their combinations.

圖9 攜帶Pigm 高世代回交株系的穗頸瘟抗性表現(xiàn)Fig.9.Resistance performance of advanced backcrossing lines withPigm and the corresponding recurrent parents.

3 討論

3.1 江蘇近年育成的粳稻新品種/系對穗頸瘟的抗性總體較弱

由于每年流行的稻瘟病菌優(yōu)勢生理小種可能不同，并直接影響品種的抗性表型[33]。因此，就生產(chǎn)實(shí)踐而言，定期采集新近流行的小種對推廣或?qū)彾ㄆ贩N的稻瘟病抗性尤其是穗頸瘟抗性進(jìn)行鑒定和評價(jià)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用江蘇省植物保護(hù)研究所劉永峰團(tuán)隊(duì)2018 年采集分離的6個(gè)代表性小種，對江蘇近年育成的粳稻新品種/系的進(jìn)行穗頸瘟接種鑒定。發(fā)現(xiàn)2019 年前審定的品種中病級小于等于5 級的品種比例（14.8%）明顯低于2019 年區(qū)試新品種（42.9%）（圖5-B），這暗示當(dāng)年審定時(shí)抗性過關(guān)的多數(shù)品種可能不適應(yīng)新流行的優(yōu)勢小種了。另外，在供試的158 份粳稻品種中，病級小于等于5 級的品種占比不到30%，大多數(shù)品種表現(xiàn)感和高感（圖5-A）。供試品種總體可分為4 種生態(tài)型，覆蓋江蘇從南至北的所有粳稻生態(tài)區(qū)，比較顯示，盡管中熟中粳中抗性好的品種比例略高于另兩種生態(tài)型，但總體差異不太明顯（圖5-A）。這暗示江蘇水稻生產(chǎn)上的稻瘟病暴發(fā)流行風(fēng)險(xiǎn)巨大。

3.2 江蘇粳稻品種的穗頸瘟抗性改良方法

通過分子標(biāo)記輔助目標(biāo)基因選擇是開展抗稻瘟病育種的最高效方法，但是需要了解目標(biāo)基因的分布狀態(tài)和潛在的育種價(jià)值。通過對14 個(gè)抗稻瘟病基因的檢測分析（圖2），發(fā)現(xiàn)除Pigm外其余的13 個(gè)抗病基因在供試材料中都有分布，其中Pib分布頻率最高，達(dá)到了72%，這與陳濤等[33]、張善磊等[34]和李剛等[12]研究結(jié)果一致，表明Pib在江蘇粳稻育種中得到了廣泛應(yīng)用。除此之外，Pita和Pikh在江蘇粳稻品種中也有相對較多的分布，其余基因的出現(xiàn)頻率均在30%以內(nèi)，而Pi25、Pit、Pi1和Pi3/5/i甚至不足15%。有意思的是，相對于已審定品種，Pid3、Pid2、Pia、Pb1等4 個(gè)基因在區(qū)試品種/系中的出現(xiàn)頻率明顯高于已審定品種（圖4），暗示這些基因在江蘇近年粳稻育種中的應(yīng)用頻率得到了明顯提高。就品種而言，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)品種攜帶2～5 個(gè)基因，也有個(gè)別品種/系攜帶了7 個(gè)和9個(gè)基因（圖2-B），但我們發(fā)現(xiàn)品種攜帶的基因數(shù)與抗性沒有顯著相關(guān)性（圖6），這暗示在以基因?qū)蚩剐詾橹鞯目沟疚敛∮N中，需要考慮的是關(guān)鍵基因或組合的應(yīng)用，而不是簡單的進(jìn)行抗病基因累加。

通過邏輯回歸分析（圖7），發(fā)現(xiàn)除了Pigm基因以外，其余13 個(gè)基因中只有Pia、Pi3/5/i和Pita對穗頸瘟抗性有顯著貢獻(xiàn)。通過病級數(shù)據(jù)差異比較，發(fā)現(xiàn)Pita單獨(dú)存在時(shí)的抗性效應(yīng)不顯著，而Pia和Pi3/5/i單獨(dú)存在時(shí)均可顯著提高抗性，且兩者間的抗性效應(yīng)相當(dāng)（圖8）。這一結(jié)果與朱勇良等[13]認(rèn)為以Pita為代表的一些抗性基因?qū)K粳稻的穗頸瘟抗性正在逐漸喪失的結(jié)論相近，但與王軍等[14]對2007-2013 年江蘇省審定的粳稻品種的研究結(jié)論不盡一致，其認(rèn)為攜帶Pita、Pib和Pikm的材料穗頸瘟抗性總體較好。此外，曾曉珊等[35]利用江蘇的72 個(gè)菌株對Pia基因的供體愛知旭進(jìn)行了抗譜分析，發(fā)現(xiàn)抗性頻率達(dá)到了83.3%，這與本研究的結(jié)果一致。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)Pia的抗性較弱，如Abdullah 等[36]通過離體接種的方法，評價(jià)了江蘇67個(gè)水稻品種對已經(jīng)明確抗瘟基因型反映的22 個(gè)稻瘟病菌株的抗性水平，發(fā)現(xiàn)攜帶有Pia基因的品種抗性并不理想?？傮w而言，產(chǎn)生以上不盡一致的結(jié)果可能與彼此選用的材料、接種方法和接種菌株不同有關(guān)。

在針對上述3個(gè)基因的抗性效應(yīng)評價(jià)中（圖8），盡管Pita單獨(dú)存在時(shí)沒有抗性效應(yīng)，但當(dāng)其與Pia或Pi3/5/i間聚合時(shí)，可顯著增強(qiáng)后者的抗病效應(yīng)，表明Pita與這兩個(gè)基因間均存在顯著的正向互作效應(yīng)，且Pita+Pia的互作效應(yīng)顯著強(qiáng)于Pita+Pi3/5/i，攜帶Pia+Pita雙基因聚合的品種均達(dá)到了抗病和高抗水平。有關(guān)稻瘟病基因間可能存在的不同互作關(guān)系，前人已有不少研究[15,29,37]。這表明在育種實(shí)踐中，選擇合適的基因組合可起到事半功倍的效果，否則將適得其反甚至徒勞無功。本研究顯示，在當(dāng)前和今后的江蘇粳稻抗稻瘟病育種中，應(yīng)該重視Pia與Pi3/5/i或Pita間的聚合育種，尤其是與Pita間的聚合育種。可喜的是，2019 年區(qū)試新品種中Pia的檢出頻率明顯高于已審定品種，加上有近一半的江蘇粳稻品種攜帶了Pita，因此，未來應(yīng)該可以快速實(shí)現(xiàn)這兩個(gè)基因在江蘇粳稻品種中的聚合育種，提升江蘇粳稻品種的穗頸瘟抗性水平。

除了通過基因聚合實(shí)現(xiàn)品種廣譜性和持久性抗性外，挖掘和利用廣譜持久性抗性單基因無疑具有更重要的價(jià)值。從谷梅4 號中克隆到的Pigm被認(rèn)為具有廣譜持久的稻瘟病抗性[7,38]。目前Pigm已被廣泛用于國內(nèi)多個(gè)水稻生態(tài)區(qū)的稻瘟病抗病育種[39-40]。曾生元等[41]通過標(biāo)記輔助選擇，將Pigm導(dǎo)入江蘇三個(gè)不同生態(tài)型粳稻品種中，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入系對南方毒性小種均表現(xiàn)出較強(qiáng)的穗頸瘟抗性。李育紅等[42]將Pigm基因?qū)氲缴a(chǎn)上廣泛使用的光溫敏感型核不育系廣占63-2S 中，育成了苗瘟和穗瘟抗性顯著提升的新光溫敏感型核不育系揚(yáng)秈3S。本研究發(fā)現(xiàn)，江蘇近年育成新品種/系中均不含有Pigm基因，通過標(biāo)記輔助選擇，分別在感病品種HD119和WYJ32 背景中構(gòu)建了14 份回交高世代株系，接種鑒定結(jié)果顯示，所有攜帶Pigm的株系均表現(xiàn)為抗病或高抗（圖9-A, B）。這表明，Pigm在江蘇粳稻穗頸瘟抗性改良中具有較高的育種利用價(jià)值。

以上研究表明，抗病基因組合“Pia+Pita”及抗病基因Pigm在江蘇粳稻抗穗頸瘟育種中具重要應(yīng)用價(jià)值，當(dāng)然今后仍然需要不斷增加接種小種的數(shù)量，以評估其抗性廣譜性和持久性。另外，這三個(gè)基因位于不同的染色體位置，下一步有必要詳細(xì)評估三個(gè)基因間的不同組合效應(yīng)，包括三者間的聚合是否有利于進(jìn)一步增強(qiáng)江蘇粳稻品種對穗頸瘟的廣譜性和持久性抗性。