張立成 李懿星 王天抗 邱牡丹 宋書(shū)鋒 董皓, 李磊 劉建豐 李莉,

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128;2 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南雜交水稻研究中心, 長(zhǎng)沙 410125;3 湖南大學(xué)研究生院 隆平分院, 長(zhǎng)沙410125;*通信聯(lián)系人, E-mail: lili@hhrrc.ac.cn; liujf501@aliyun.com)

抽穗期是水稻最重要的農(nóng)藝性狀之一，與產(chǎn)量密切相關(guān)，由主效和微效QTL/基因共同控制。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多科學(xué)家對(duì)水稻抽穗開(kāi)花機(jī)制進(jìn)行了大量深入的研究。

Dof（DNA binding with one finger）是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它屬于鋅指蛋白超家族（zinc finger super-family），一般由200～400 個(gè)氨基酸組成[1-2]，其N 末端含有由4 個(gè)Cys 殘基與Zn2+共價(jià)結(jié)合形成的單鋅指保守DNA 結(jié)合域，其C 末端含轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域[3]。N 末端的Dof 結(jié)構(gòu)域由52 個(gè)氨基酸組成且含有保守的C2-C2型單鋅指結(jié)構(gòu)域[4]。Zn2+和Cys 殘基是維持Dof 蛋白功能所必需的，對(duì)二者的替換或破壞都會(huì)使Dof 蛋白的活性喪失[5]。Dof 結(jié)構(gòu)域中的單鋅指及鋅指旁邊C 側(cè)鏈狀結(jié)構(gòu)中某些特定氨基酸均能與DNA 結(jié)合，這種DNA 與蛋白質(zhì)雙功能結(jié)合活性，使Dof 蛋白可以調(diào)控多種基因的表達(dá)[6]。Dof 蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與了激素響應(yīng)、貯藏蛋白表達(dá)和光周期響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。如煙草的Dof 蛋白NtBBF1 可調(diào)節(jié)受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)表達(dá)的植物癌基因rolB的表達(dá)[7]；水稻中的Dof 蛋白R(shí)PBF 可與RISBZ1 相互作用調(diào)節(jié)胚乳特異性貯藏蛋白[8]，OsDof12過(guò)量表達(dá)植株在長(zhǎng)日條件下能夠通過(guò)上調(diào)表達(dá)Hd3a和OsMADS14基因來(lái)縮短水稻抽穗時(shí)間[9]。擬南芥中的AtDof5.1可以調(diào)節(jié)葉片的軸向卷曲[10]；OBP1在水楊酸和氧化脅迫下調(diào)控植物防御基因表達(dá)[11]；OBP3通過(guò)調(diào)節(jié)光敏色素與隱花素來(lái)影響植物發(fā)育過(guò)程中的光形態(tài)[12]。

Yanagisawa 等[13]在玉米中鑒定了第一個(gè)Dof蛋白MNB1 后，Dof 家族進(jìn)入研究者的視界，目前在擬南芥和水稻基因組中共預(yù)測(cè)存在36 個(gè)和30 個(gè)Dof基因[14]，在小麥、大麥和大豆中分別預(yù)測(cè)存在31、26、28 個(gè)[15-17]。Dof 家族廣泛存在于整個(gè)植物界[18]，但其中大部分基因的功能尚未明晰。

我們前期通過(guò)穗發(fā)育芯片篩選到大量可能與穗發(fā)育相關(guān)的基因，本研究選取其中的OsDof6，采用反向遺傳學(xué)的方法，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，期望通過(guò)對(duì)突變體性狀進(jìn)行觀察來(lái)獲得該基因功能，并通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)與實(shí)時(shí)定量PCR 等方式獲得該基因的表達(dá)模式，為深入了解該基因所參與的生命進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用粳稻品種9522（武運(yùn)粳7 號(hào)），所用大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株EHA105 均保存于雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；CRISPR/Cas9 載體系統(tǒng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光課題組提供。將T1突變體和9522 野生型種植于湖南省長(zhǎng)沙市湖南雜交水稻研究中心試驗(yàn)基地，種植密度為16 cm×20 cm，每行8 株，每個(gè)群體種植3 行，2019 年6 月5 日播種，6 月25 日移秧，常規(guī)大田管理。

1.2 生物信息學(xué)分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在TIGR（http://rice.plantbiology.msu.edu/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索OsDof6，獲得該基因的基因組、CDS、ATG 上游1500 bp 啟動(dòng)子序列及蛋白序列。將該基因蛋白序列輸入 SMART （ http://smart.emblheidelberg.de/）獲得該蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)，將啟動(dòng)子序列輸入至PlantCARE （ http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），獲得該啟動(dòng)子中可能的調(diào)控元件，在 PlantTFDB （Plant Transcription Factor Database, planttfdb.cbi.pku.edu.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索Dof，并根據(jù)周淑芬[19]、紀(jì)劍輝等[20]的研究，確定了30 個(gè)Dof 家族成員的基因，利用ClustalX 軟件對(duì)這30 個(gè)基因的序列進(jìn)行多重序列比較，制作水稻Dof 家族進(jìn)化樹(shù)。

1.3 基因組織表達(dá)分析

利用TRIZOL，分別提取水稻根、莖、葉、穗（穗長(zhǎng)1～2 mm、5～10 mm、15～50 mm、50～100 mm、穗變綠及即將抽穗等6 個(gè)時(shí)期）各個(gè)部位的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，利用在線工具（http://www.oligoarchitect.com/LoginServlet）設(shè)計(jì)OsDof6的qPCR 引物qPCR-Dof6-F 和qPCR-Dof6-R（表1），以各個(gè)部位cDNA 為模板，以Ubq（Os03g13170）為內(nèi)參，對(duì)OsDof6各個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 OsDof6 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建及煙草瞬時(shí)表達(dá)

利用同源重組的方式，設(shè)計(jì)引物1300-Dof6-F和1305-Dof6-R（表1）擴(kuò)增OsDof6去掉終止密碼子的CDS 序列并連接到pCAMBIA1305 載體上，獲得1305-Dof6-GFP 表達(dá)載體，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌涂板，挑取單菌落進(jìn)行PCR 并測(cè)序，選擇測(cè)序結(jié)果正確的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，將含有1305-Dof6-GFP 載體、1305-GFP 載體和p19 載體的農(nóng)桿菌單克隆搖菌過(guò)夜，次日取出，4 000 r/min 下離心10 min，調(diào)OD 值至0.6 左右，加入1/50 體積0.5 mol/L MES（pH=5.6）和1/500 體積的0.1 mol/L乙酰丁香酮，混勻后室溫靜置3 h。將含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液和p19 農(nóng)桿菌菌液按照1∶1 體積比混合，從煙草葉片背軸面注射，避光培養(yǎng)36～48 h，取葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。

1.5 CRISPR/Cas9 特異性靶點(diǎn)選擇及載體構(gòu)建

將OsDof6的基因序列輸入E-CRISP (www.ecrisp.org)靶標(biāo)位點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站中，對(duì)PAM 及5′端堿基要求選擇medium 選項(xiàng)，選擇靠近起始密碼子或保守結(jié)構(gòu)域處NGG 上游20 bp 序列，將所有結(jié)果通過(guò)NCBI 進(jìn)行BLAST，選擇特異性較強(qiáng)的一個(gè)，即CCGGTACAAGCAGGGCGCCGAGG，靶位點(diǎn)標(biāo)記為T1，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)引物Dof6-U3-F 和Dof6-U3-R。載體構(gòu)建、鑒定與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化參考鄧堯的方法[21]。

表1 引物序列Table 1.Primer sequence.

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷組織轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株基因型檢測(cè)

將成熟的9522 種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，用上一步的農(nóng)桿菌菌液侵染愈傷組織，置于共培培養(yǎng)基20℃下暗培養(yǎng)3 d，之后將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無(wú)菌水沖洗3～5 次，置于含潮霉素、頭孢噻肟鈉和氨芐青霉素篩選培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 周后更換新的篩選培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2 周，再經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)后，得到幼苗植株。將植株移入大田種植，提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片基因組DNA。以該 DNA 為模板，用檢測(cè)引物 JC-Dof6-F 和JC-Dof6-R（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為491 bp。將PCR 產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序，Chromas 讀取測(cè)序峰圖，利用NCBI 網(wǎng)站BLAST 工具對(duì)序列進(jìn)行對(duì)比，分析T0轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)序列變化。

1.7 OsDof6突變體表型鑒定

參考趙金成[22]的方法，從見(jiàn)穗日起至齊穗為止，每天9:00-10:00 調(diào)查T1株系內(nèi)所有植株的抽穗情況，主穗穗頂端伸出劍葉1 cm 記該單株抽穗，株系內(nèi)50%單株抽穗為整個(gè)株系抽穗期，80%單株抽穗為齊穗期，同時(shí)統(tǒng)計(jì)株系內(nèi)所有單株抽穗水平繪制抽穗動(dòng)態(tài)圖。此外，調(diào)查突變體與對(duì)照的株高、分蘗數(shù)、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等。用DPS 7.5 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)量性狀等進(jìn)行方差分析。

1.8 抽穗期相關(guān)基因差異表達(dá)分析

提取突變體與野生型穗發(fā)育初期葉片總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法，檢測(cè)抽穗期相關(guān)基因的表達(dá)量(引物見(jiàn)表1)，分析這些基因在突變體與野生型中的表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsDof6生物信息學(xué)特征

OsDof6位于水稻第1 染色體上，該基因全長(zhǎng)993 bp，CDS 總長(zhǎng)963 bp，含有1 個(gè)外顯子，編碼一個(gè)含有320 個(gè)氨基酸的蛋白(圖1-A)。利用PlantCARE 在線工具對(duì)該基因起始密碼子上游1.5 kb 啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該基因的啟動(dòng)子中包含大量的光響應(yīng)元件，茉莉酸甲酯、赤霉素等植物激素響應(yīng)元件，植物組織表達(dá)相關(guān)元件及逆境響應(yīng)元件(表2)。表明該基因可能參與了植物光周期、激素調(diào)節(jié)、組織發(fā)育等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。利用SMART 對(duì)該基因的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在其22～80 aa 處存在一個(gè)zf-Dof 保守結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

高度保守的C2-C2 類型鋅指結(jié)構(gòu)是植物Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族的核心結(jié)構(gòu)域。此外，在不同Dof 亞家族中，除C2-C2 類型鋅指結(jié)構(gòu)域外，還存在一些相對(duì)保守的基序，然而序列的保守性在一定程度上能夠反映其在功能上的相似性[23]。為了預(yù)測(cè)OsDof6的功能，從PlantTFDB 上檢索了30 個(gè)水稻Dof 家族的候選基因，進(jìn)一步對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行多重對(duì)比，構(gòu)建出水稻Dof 家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)OsDof6與OsDof20處于同一分支（圖1-C），對(duì)OsDof20的表達(dá)模式進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因主要在花藥及穎殼的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)。OsDof20的具體功能及其與OsDof6的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

2.2 OsDof6的表達(dá)模式及編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

利用RiceXpro 表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OsDof6的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，OsDof6在葉鞘、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的根部和生殖生長(zhǎng)期的莖部表達(dá)量較高，在內(nèi)外稃發(fā)育中后期表達(dá)量最高(圖2-A)。進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)定量PCR 對(duì)OsDof6在水稻根、莖、葉、穗P3 期(穗長(zhǎng)1～2 mm)、穗P4 期(穗長(zhǎng)5～10 mm)、穗P5 期(穗長(zhǎng)15～50 mm)、穗P6 期(穗長(zhǎng)50～100 mm)、穗P7 期(穗變綠)、穗P8 期(即將抽穗)等組織器官中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OsDof6屬于組成型表達(dá)，在根、莖、葉和穗中均檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本，然而在穗發(fā)育的P7 期和P8 期表達(dá)水平明顯高于其他部位（圖2-B）。

圖1 OsDof6基因核苷酸序列(A)、蛋白結(jié)構(gòu)(B)與家族進(jìn)化分析(C)Fig.1.OsDof6 nucleotide sequence(A) and its protein structure(B) and phylogenetic analysis of OsDof family(C).

表2 OsDof6基因ATG 上游1.5 kb 啟動(dòng)子區(qū)域功能元件分析Table 2.Functional element analysis of the 1.5 kb promoter region upstream ofOsDof6 gene ATG.

圖2 OsDof6基因時(shí)空表達(dá)分析Fig.2.Temporal and spatial expression analysis ofOsDof6 gene.

圖3 OsDof6亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.3.Subcellular localization result ofOsDof6.

通過(guò)同源重組的方式，將OsDof6的cDNA 序列（不包含終止密碼子TAA）整合到pCAMBIA1305-GFP載體上，獲得pCAMBIA1305-Dof6-GFP植物融合表達(dá)載體，將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并侵染煙草葉片表皮細(xì)胞，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察Dof6-GFP 融合蛋白的熒光信號(hào)（圖3），Dof6-GFP融合蛋白主要定位在細(xì)胞核中，而在空載對(duì)照的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均能檢測(cè)到熒光信號(hào)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsDof6 特異定位于細(xì)胞核中。

2.3 獲得OsDof6基因突變體植株

為了進(jìn)一步研究OsDof6在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，構(gòu)建了OsDof6基因編輯載體。經(jīng)過(guò)PCR 鑒定與序列比對(duì)，OsDof6的靶位點(diǎn)成功構(gòu)建入pYLCRISPR/Cas9-MT載體中，獲得了植物表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9-MT-Dof6（圖4-A）。將該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻9522 愈傷組織并鑒定，共獲得4 株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株9522Dof6-1、9522Dof6-2、9522Dof6-3和9522Dof6-4，其中9522Dof6-2、9522Dof6-3和9522Dof6-4在靶位點(diǎn)處出現(xiàn)突變，9522Dof6-1未發(fā)生突變。9522Dof6-2和9522Dof6-3具有相同的突變類型，該突變使得原基因序列的第62～69 bp 共8 個(gè)堿基缺失，直接導(dǎo)致閱讀框移碼致使翻譯提前終止，破壞了Dof 蛋白的結(jié)構(gòu)，形成了一個(gè)與Dof蛋白完全不同的108 aa的蛋白（圖4-D）。9522Dof6-4使得原基因序列第11～313 bp 共303 個(gè)堿基丟失，即氨基酸序列第4～104 aa 共100 個(gè)氨基酸缺失，該突變使Dof 保守結(jié)構(gòu)域完全缺失。

圖4 OsDof6基因編輯載體構(gòu)建與突變體突變類型分析Fig.4.Construction ofOsDof6 gene editing vector and analysis of mutation types of mutants.

圖5 野生型9522 與Dof6 突變體的表型比較Fig.5.Phenotypic comparison between the wild type 9522 and theDof6 gene-knock-out mutant.

圖6 抽穗期主要調(diào)控基因差異表達(dá)分析Fig.6.Analysis of expression levels of main genes for heading date.

表3 突變體與對(duì)照的產(chǎn)量性狀調(diào)查Table 3.Investigation of yield traits in mutants and controls.

2.4 OsDof6突變體延遲抽穗

對(duì)9522Dof6-1（陰性對(duì)照）、9522Dof6-3、9522Dof6-4和9522 野生型的抽穗動(dòng)態(tài)調(diào)查結(jié)果顯示，9522 野生型和9522Dof6-18 月20 日始穗，8 月24 日進(jìn)入抽穗期，8 月26 日齊穗，播始?xì)v期為77 d，而突變體9522Dof6-3和9522Dof6-48 月23 日始穗，8 月27 日進(jìn)入抽穗期，8 月29 日齊穗（圖5-A，見(jiàn)上頁(yè)），播始?xì)v期為80 d。突變體材料進(jìn)入抽穗期的時(shí)間與野生型和陰性對(duì)照相比平均推遲3 d 左右（圖5-B）。但在抽穗歷期與抽穗速度上無(wú)顯著變化。對(duì)突變體與野生型9522 和陰性對(duì)照9522Dof6-1的產(chǎn)量性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，突變體的平均分蘗數(shù)為15.70 和15.75 個(gè)，顯著低于陽(yáng)性對(duì)照9522 野生型的19.0 個(gè)和陰性對(duì)照9522Dof6-1的18.7 個(gè)，而突變體與野生型在株高、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等產(chǎn)量相關(guān)因素上無(wú)顯著差異，突變體的單株產(chǎn)量由于分蘗數(shù)的下降而顯著降低（表3）。由此可知，OsDof6的功能缺失影響到突變體材料的抽穗期、分蘗數(shù)和單株產(chǎn)量。

2.5 OsDof6功能缺失影響了Ghd7 的表達(dá)

為了探索OsDof6基因所參與的分子調(diào)控途徑，選取了抽穗期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的幾個(gè)重要的基因Hd1、Ghd7、Hd3a及RFT1。以幼穗發(fā)育初期葉片總RNA為模板，在突變體與野生型中進(jìn)行了差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在突變體中Ghd7基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，Hd1基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化；而成花素基因Hd3a及RFT1的表達(dá)量無(wú)顯著變化（圖6）。

3 討論

抽穗期是水稻一個(gè)重要的農(nóng)藝性狀，它主要由品種的感溫性、感光性和基本營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)性決定[22]。目前已有大量的水稻抽穗期相關(guān)QTL被精細(xì)定位并克隆。如開(kāi)花促進(jìn)基因DTH3[24]、Ehd4[25]，開(kāi)花抑制基因Hd16[26]，成花素基因Hd3a[27]和RFT1[28]等水稻Dof家族部分成員也是具有調(diào)控抽穗期的功能。其中，OsDof12基因過(guò)量表達(dá)可在長(zhǎng)日條件下上調(diào)Hd3a和OsMADS14基因的表達(dá)從而縮短抽穗期，但其過(guò)量表達(dá)在短日條件下對(duì)抽穗期無(wú)影響[9]。OsDof4的過(guò)量表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)日條件下抽穗提前，短日條件下抽穗延遲[29]。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)水稻品種9522的OsDof6基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，獲得了兩種不同突變類型的純合功能缺失突變體。對(duì)這兩份突變體材料的T1代生育期觀察發(fā)現(xiàn)，突變體材料與野生型及陰性對(duì)照相比抽穗推遲3 d。而在產(chǎn)量性狀中，突變體材料除分蘗數(shù)與野生型相比顯著下降外，其他性狀均無(wú)明顯差異。并且，抽穗動(dòng)態(tài)調(diào)查發(fā)現(xiàn)分蘗數(shù)的減少對(duì)抽穗歷期與抽穗速率無(wú)顯著影響。Dof家族中Dof功能結(jié)構(gòu)域在不同物種間均表現(xiàn)出高度保守，其功能可能也存在著一定的保守。水稻Dof家族中OsDof12與OsDof4的功能均有報(bào)道為開(kāi)花相關(guān)。對(duì)水稻Dof家族進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)與OsDof6親緣關(guān)系最近的成員是OsDof20。我們對(duì)其進(jìn)行的時(shí)空表達(dá)模式預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其主要在花藥發(fā)育與穎殼發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，其具體功能有待進(jìn)一步研究。值得注意的是，Tsuji等[30]發(fā)現(xiàn)成花素基因Hd3a在葉片韌皮部合成之后，除了會(huì)運(yùn)輸?shù)角o尖分生組織影響水稻抽穗外，還會(huì)在腋生分生組織中積累，以促進(jìn)水稻分蘗。對(duì)OsDof6的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該基因在水稻根、莖、葉中的表達(dá)量較高，在內(nèi)外稃發(fā)育后期表達(dá)量最高，與預(yù)測(cè)結(jié)果吻合。對(duì)OsDof6序列分析得知在其啟動(dòng)子中含有大量的光響應(yīng)元件，少量組織表達(dá)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件以及激素響應(yīng)元件，推測(cè)其可能具有響應(yīng)光周期的功能。在抽穗期主要調(diào)控基因差異表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，Ghd7基因的表達(dá)量極顯著上調(diào)。Dai等[31]的研究表明，在長(zhǎng)日照的環(huán)境下，Ghd7的表達(dá)量上升可以抑制Hd3a與RFT1的表達(dá)使水稻的抽穗期延遲，與Dof6突變體的表型一致。成花素基因Hd3a與RFT1表達(dá)量沒(méi)有顯著變化可能是由于抽穗期變化幅度較小、Dof家族基因功能冗余[32]所致。綜上所述，OsDof6在長(zhǎng)日條件下可能參與Ghd7-Hd1-Hd3a/RFT1通路，通過(guò)光周期調(diào)節(jié)或調(diào)節(jié)穗部發(fā)育的方式來(lái)影響抽穗期。

后續(xù)將對(duì)該突變體進(jìn)行過(guò)量表達(dá)、功能互補(bǔ)等研究對(duì)該表型進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。并對(duì)該基因的互作蛋白進(jìn)行挖掘，以探究該基因在影響抽穗期過(guò)程中的分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。