唐小涵 劉世家 劉喜 田云錄 王云龍 滕烜 段二超 張?jiān)?江玲張文偉 王益華, 萬建民,

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 南京 210095;2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所/中國農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程, 北京100081;*通信聯(lián)系人, E-mail: yihuawang@njau.edu.cn)

水稻（Oryza sativaL.）作為世界上最重要的糧食作物之一，其食用部分胚乳的發(fā)育狀況直接影響稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)。胚乳粉質(zhì)主要是因?yàn)榕呷橹性旆垠w和蛋白體充實(shí)不良、相互間存在空隙造成，該表型降低了稻米外觀品質(zhì)和碾磨品質(zhì)，并對食味和營養(yǎng)品質(zhì)產(chǎn)生影響[1]。谷類作物中，淀粉在胚乳造粉體中合成，主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。淀粉的生物合成主要通過4 類淀粉合成關(guān)鍵酶共同參與：ADP 葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）以及淀粉脫分支酶（DBE）[2]。另外，葡聚糖-水二激酶（GWD）、磷酸葡聚糖-水二激酶（PWD）、α-葡聚糖磷酸化酶（PHO）以及FLO6、PTST、SSG4 等靶向淀粉顆粒的蛋白被證實(shí)對淀粉合成具有重要影響[3-9]。除淀粉合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶類，還有證據(jù)表明，胚乳中淀粉合成也受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、貯藏蛋白運(yùn)輸異常等蛋白合成及分選相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)的影響[10]。例如，Hunter 等[11]使用基因芯片研究經(jīng)典的玉米胚乳粉質(zhì)突變體o1,o2,o5,o9,o11,Mc,DeB30和fl2的基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，編碼重鏈結(jié)合蛋白（Bip）、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）、熱激蛋白70（HSP70）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫響應(yīng)的基因表達(dá)均顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中過表達(dá)或抑制Bip1的表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制（ER quality control）相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，并形成粉質(zhì)胚乳[12]。水稻PDI 缺失同樣會(huì)導(dǎo)致籽粒粉質(zhì)表型，這可能是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（ER stress）影響淀粉合成相關(guān)酶的活性[13]。此外，GPA1/OsRab5a 、 GPA2/OsVPS9a 、 GPA3 、GPA4/GOT1B和GPA6/OsNHX5等蛋白在貯藏蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸以及水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，發(fā)生基因突變會(huì)造成谷蛋白前體異常積累，且成熟種子呈現(xiàn)出粉質(zhì)表型[14-18]。

tRNA 的氨?；堑鞍踪|(zhì)合成的第一步，在該過程中aaRSs 將特定氨基酸連接到同源tRNA 以完成蛋白質(zhì)合成[19]。該過程分兩步實(shí)現(xiàn)，首先aaRSs協(xié)助氨基酸與三磷酸腺苷縮合形成緊密結(jié)合的氨基酰腺苷酸（aa-AMP），釋放無機(jī)焦磷酸（PPi）；隨后，活化的aa-AMP 從腺苷酸轉(zhuǎn)移到tRNA 的3′端，形成aa-tRNA 并釋放AMP 和aaRS。由于它們在蛋白質(zhì)合成中的重要作用，編碼aaRSs 的基因在生命誕生時(shí)隨之出現(xiàn)，這個(gè)通常由20 個(gè)酶組成的家族（每個(gè)氨基酸對應(yīng)一個(gè)aaRS）受到進(jìn)化壓力的限制始終保持這一基本活性[20]?；诘鞍捉Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)的差異，aaRSs 被分為兩類，第Ⅰ類酶具有HIGH、KMSKS 兩段保守基序和羅斯曼折疊（Rossmann fold, RF）作為活性中心結(jié)構(gòu)，第Ⅱ類酶催化結(jié)構(gòu)則圍繞反向平行的β 折疊形成，其中色氨酰-tRNA 合成酶（tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS）屬于第Ⅰ類酶，它是由兩個(gè)相同亞基組成的雙亞基酶，單個(gè)亞基肽鏈長度約330 個(gè)氨基酸，隨種屬來源不同長度略有變化[20-21]。

作為一類看家蛋白，aaRSs 普遍存在于所有具有蛋白質(zhì)合成能力的生物體中，由于細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)翻譯機(jī)制具有不同的系統(tǒng)發(fā)生起源，每一個(gè)真核生物都攜帶數(shù)個(gè)特定aaRSs 間隔區(qū)室，分別用于細(xì)胞質(zhì)翻譯及細(xì)胞器翻譯[22]。除了氨基?；δ芡猓蠹s一半的aaRSs 還具有校對功能，可以從同源tRNA 中去除錯(cuò)誤的氨基酸[23]。同時(shí)，aaRSs 在進(jìn)化過程中還衍生出其他生物學(xué)功能。以哺乳動(dòng)物的WRS 為例，它可以通過選擇性剪接和蛋白水解切割進(jìn)一步擴(kuò)展功能，并且WRS 還可以異位至細(xì)胞核乃至胞外空間，在非特異性免疫的激活、血管生成和γ-干擾素（Interferon-γ, IFN-γ）信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[24]。另外，胞質(zhì)的一些aaRSs 和1～3 個(gè)輔助因子組成多合成酶復(fù)合物（multi-protein complex,MSC）保留在胞質(zhì)中，可以在特定的生理或應(yīng)激條件下從這些復(fù)合物中釋放出來，重新定位到其他亞細(xì)胞區(qū)室發(fā)揮非常規(guī)功能。綜合這些特性，高等生物中的氨酰-tRNA 合成酶被認(rèn)為是“系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的守護(hù)者”[25-26]。

在植物中，關(guān)于aaRSs 在生長發(fā)育中所起的生物功能方面的研究也取得了一些進(jìn)展。擬南芥有45個(gè)aaRSs，其中21 個(gè)是胚珠發(fā)育和胚胎發(fā)生所必需的[27]。水稻谷氨酰-tRNA 合成酶OsERS1 在花藥發(fā)育早期維持體細(xì)胞組織正常發(fā)育，并限制雄性生殖細(xì)胞的過度增殖[28]。定位于線粒體的半胱氨酰-tRNA 合成酶（SYCO）在雌性配子體的中央細(xì)胞中表達(dá)，影響相鄰的反足細(xì)胞壽命[29]。一些質(zhì)體定位的aaRSs 突變體植株呈現(xiàn)明顯的葉色表型，伴隨細(xì)胞器數(shù)量顯著減少或葉綠體中核糖體生物合成缺陷等問題[30-32]。編碼線粒體天冬氨酰-tRNA 合成酶（AspRS）的OKI1通過維持WUS-CLV3 反饋調(diào)節(jié)途徑關(guān)鍵基因表達(dá)以維持莖間分生組織（SAM）的大小[33]。小麥TaMetRS基因受脫氧雪腐鐮刀菌烯醇激活表達(dá)，影響其他基因的轉(zhuǎn)錄以抵御真菌病原體或真菌毒素[34]。IBI1編碼的天冬氨酰-tRNA 合成酶（AspRS）作為β-氨基丁酸（BABA）的植物受體參與防御反應(yīng)[35]。但植物中有關(guān)色氨酰-tRNA 合成酶的研究尚未見報(bào)道。

本研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)wrs1突變體，該突變體成熟種子胚乳腹部粉質(zhì)皺縮，純合突變體幼苗致死，進(jìn)一步分析該突變體的籽粒理化性質(zhì)并結(jié)合胚乳淀粉結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)該突變體存在明顯的淀粉合成缺陷，通過圖位克隆的方法證明該表型是由編碼色氨酰-tRNA 合成酶（WRS1）的基因突變造成，該基因在胚乳中有較高的表達(dá)量。我們的數(shù)據(jù)還表明，這個(gè)細(xì)胞質(zhì)定位的色氨酰-tRNA 合成酶突變后可能影響游離氨基酸穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而阻礙蛋白的合成和淀粉的積累，最終導(dǎo)致胚乳發(fā)育和水稻幼苗生長嚴(yán)重受阻。

1 材料與方法

1.1 材料

wrs1是從秈稻品種N22 的EMS 突變體庫中篩選得到的一份穩(wěn)定遺傳的胚乳腹部粉質(zhì)皺縮突變體。選擇雜合單株與粳稻品種滇粳優(yōu)1 號配制雜交組合用于基因的精細(xì)定位。

基因定位的F2群體種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋?qū)嶒?yàn)基地，其余實(shí)驗(yàn)材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 掃描電鏡觀察

將野生型和突變體成熟種子自然斷開，后續(xù)樣品的制備由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)室完成，采用日立S-3000N 電子掃描顯微鏡觀察和拍照記錄。

1.3 胚乳半薄切片觀察

取灌漿10 d 的胚乳，參照Long 等[36]所述方法切成1 μm 厚度的薄片。切片用0.05% I2-KI 溶液染色后，在Zeiss AX10 熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 成熟種子理化指標(biāo)測定

成熟種子去殼，磨成米粉并過篩（孔徑為0.15 mm），50℃下烘干至恒重。

采用Megazyme 總淀粉測定試劑盒測定總淀粉含量。按照農(nóng)業(yè)部NY147-88 標(biāo)準(zhǔn)測定直鏈淀粉含量。采用全自動(dòng)凱氏定氮儀（KJELTEC2300 型，F(xiàn)OSS 公司）測定總氮含量，換算成蛋白質(zhì)含量（轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.95），根據(jù)種子干質(zhì)量進(jìn)一步計(jì)算出平均每粒糙米蛋白含量。參考Long 等[36]所述方法進(jìn)行米粉尿素膨脹實(shí)驗(yàn)，量取并記錄裝有0～9 mol/L尿素溶液的離心管中米粉可溶部分的體積，淀粉顆粒的膨脹體積＝總體積（1 mL）-可溶部分體積。采用RVA(Rapid Visco Analyzer，瑞典波通公司)快速黏度分析儀進(jìn)行米粉的黏度特性分析，每個(gè)樣品準(zhǔn)確稱取3.0 g 米粉，加入25 mL 蒸餾水混合均勻后測定。采用全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本Hitachi公司，L-8900 型）測定游離氨基酸含量，每個(gè)樣品準(zhǔn)確稱取0.4 g 米粉，充分溶解于1.5 mL 純水，將樣品置于搖床4℃下旋轉(zhuǎn)過夜；12 000 r/min 下離心15 min后吸取上清液于新的離心管中并加入等體積4%磺基水楊酸溶液，混勻后12 000 r/min 下離心15 min，0.22 μm 水系濾頭過濾上清液用于測定。

所有測定每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.5 WRS1的圖位克隆和轉(zhuǎn)基因后代鑒定

選擇雜合單株與粳稻品種滇粳優(yōu)1 號配制雜交組合，分單株收取F1植株上的種子，從有分離的單株中選取與突變體表型一致的粉質(zhì)皺縮籽粒，利用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethylammonium bromide, CTAB）法提取種子DNA，進(jìn)行基因定位。InDel 標(biāo)記來自 RiceVarMap（http://ricevarmap.ncpgr.cn/）。PCR 擴(kuò)增體系包括DNA 模板（約40 ng）1 μL，前后引物各（2 μmol/L）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.03 μL，rTaqDNA 聚合酶（5 U/μL,TaKaRa）0.1 μL，10×緩沖液（含有Mg2+）1 μL，加ddH2O 至10 μL。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR 產(chǎn)物。

利用胚乳粉質(zhì)皺縮的wrs1種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)。提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性PCR 檢測，N10 為633 bpWRS1基因特異的編碼區(qū)片段的擴(kuò)增引物，Hyg 為1081 bp的潮霉素選擇標(biāo)記基因片段的擴(kuò)增引物（表1）。收獲突變體背景的轉(zhuǎn)基因陽性植株上的種子（T1代），單粒播種，出苗后提取幼苗DNA，使用引物N4（前后引物均位于基因組序列上）進(jìn)行擴(kuò)增，并測序驗(yàn)證突變位點(diǎn)（野生型中堿基為G，突變體中堿基為T），當(dāng)突變位點(diǎn)純合而種子表現(xiàn)透明視為互補(bǔ)。

1.6 RNA 提取以及qRT-PCR

使用植物總RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)公司）提取不同組織的總RNA。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后，在美國ABI 7500 型熒光定量PCR 儀(ABI-PRISM 7500HT)上擴(kuò)增，進(jìn)行 qRT-PCR 分析，以水稻Ubiqutin基因（Os03g0718100）作為內(nèi)參，每個(gè)樣品做3 次重復(fù)。采用2?ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

反應(yīng)體系（20 μL）包括SYBR Premix ExTaqTM(TaKaRa) 10 μL，2 μmol/L 前后引物混合液5 μL，模板cDNA 5 μL（10～30 ng）。

反應(yīng)程序：95℃下預(yù)變性30 s，95℃下5 s，60℃下34 s，循環(huán)數(shù)為40；添加溶解曲線95℃下15 s，60℃下1 min，95℃下15 s。

1.7 生物信息學(xué)分析

在NCBI 網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索并下載不同物種色氨酰-tRNA 合成酶的同源蛋白，使用MEGA7 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，從PHYRE2網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)獲得蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測， 使用 ESPript3.0 網(wǎng)站(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)進(jìn)行氨基酸序列比對。

1.8 GUS 染色

GUS 工作液含50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.0，避光保存），0.1% Triton X-100，1 mmol/L 鐵氰化鉀，1 mmol/L 亞鐵氰化鉀，10 mmol/L EDTA，1 mg/mL X-Gluc。將配制好的GUS 染液加入15 mL離心管中，將轉(zhuǎn)基因樣品完全浸沒在染色液中，置于37℃培養(yǎng)箱過夜，染色后用75%乙醇對葉綠素脫色，然后拍照記錄。

1.9 亞細(xì)胞定位

構(gòu)建WRS1片段與GFP 融合載體。挑選單克隆，測序驗(yàn)證正確后采用TIANGEN 公司的無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（DP117）提取質(zhì)粒。參考文獻(xiàn)[31]進(jìn)行水稻原生質(zhì)體分離。使用Leica 公司SP8 型激光共聚焦顯微鏡觀察WRS1 的亞細(xì)胞定位情況。

1.10 種子蛋白提取以及Western blotting 分析

將成熟種子磨粉，每1 mg 米粉加入20 μL 蛋白提取液[SDS 4.0 g，尿素24.0 g，1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）12.5 mL；β-巰基乙醇5 mL；ddH2O 定容到100 mL；加入適量溴酚藍(lán)指示劑]，渦旋振蕩充分溶解，50℃下烘12 h。配制濃度為8%～18%的聚丙烯酰胺梯度分離膠，電泳結(jié)束后利用濕轉(zhuǎn)設(shè)備（Bio-Rad 公司）將蛋白轉(zhuǎn)印到孔徑為0.45 μm 的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF 膜在5%脫脂牛奶（PBST 溶解；PBST 配方：氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鉀0.27 g，磷酸氫二鈉3.85 g，500 μL 吐溫-20，雙蒸水定容至1 L）中封閉1 h，然后移至新的封閉液中加入一抗（1∶1000）孵育2 h，PBST 漂洗PVDF膜3 次，每次5 min；將PVDF 膜轉(zhuǎn)移至封閉液稀釋的二抗溶液（1∶5000）中孵育1 h，PBST 漂洗PVDF 膜3 次，每次10 min。采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光。內(nèi)參抗體為Actin 單克隆抗體（Sigma 公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 wrs1突變體的表型分析

與野生型N22 相比，wrs1突變體的成熟種子表現(xiàn)出胚變大、胚乳粉質(zhì)皺縮的表型。種子橫斷面觀察發(fā)現(xiàn)突變體種子中部和腹部表現(xiàn)為粉質(zhì)，背部則相對透明（圖1-A～B）。進(jìn)一步利用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同于野生型中高度緊密、相互擠壓成多面體排布的淀粉顆粒（圖1-C～E），wrs1粉質(zhì)部位的淀粉顆粒呈球體，排列較松散（圖1-F～H）。wrs1成熟種子千粒重下降了16.33%（圖1-N），粒寬略有下降（圖1-O）。

表1 wrs1轉(zhuǎn)基因家系鑒定所用引物Table 1.Markers used for identification inwrs1 transgenic lines.

對吸脹10 h 的種胚橫截面觀察，wrs1胚部變得狹長，結(jié)構(gòu)分化相對模糊（圖1-I～J）。與野生型相比，wrs1自種子萌動(dòng)階段始終表現(xiàn)出明顯的發(fā)育滯后，20 d 后逐漸萎蔫死亡（圖1-K～M）。以上結(jié)果表明wrs1突變體在胚乳發(fā)育、種胚形成、植株生長等多方面存在明顯缺陷。

2.2 wrs1與野生型成熟籽粒理化性質(zhì)

圖2 野生型和wrs1 突變體種子淀粉含量和理化特性分析Fig.2.Content and physicochemical characteristics of starches in mature seeds of wild-type and thewrs1 mutant.

表2 野生型wrs1 突變體淀粉RVA 譜特征分析Table 2.Analysis of RVA characteristic values of starch in wild-type and thewrs1mutant.

與野生型相比，wrs1突變體籽?？偟矸酆肯陆盗?.18%，直鏈淀粉含量無差異（圖2-A～B）?；谏鲜龅矸垲w粒形態(tài)及總淀粉含量的變化，對突變體中淀粉理化特性進(jìn)一步探究。RVA 譜分析野生型和突變體淀粉糊化特性的變化，結(jié)果表明wrs1突變體淀粉的黏度分布類似于野生型但水平較低，其峰值黏度和最終黏度分別為野生型的81.84%和87.52%（圖2-C，表2）。尿素濃度梯度溶解實(shí)驗(yàn)顯示，突變體米粉更難溶于尿素溶液中，在4 mol/L時(shí)突變體和野生型溶解體積出現(xiàn)差異，6 mol/L 時(shí)差異達(dá)到顯著（圖2-D～E）。綜上所述，wrs1突變體中胚乳的主要填充物淀粉的含量及理化特性發(fā)生相應(yīng)改變。

2.3 wrs1造粉體發(fā)育異常

鑒于以上觀察到的胚乳表型，我們想知道wrs1突變體造粉體發(fā)育是否存在異常。取開花后8 d 的胚乳樣品制備半薄切片并通過I2-KI 染色觀察。結(jié)果顯示，野生型中造粉體發(fā)育正常，內(nèi)部包含典型的水稻復(fù)合淀粉顆粒，淀粉顆粒充實(shí)，呈規(guī)則的多面體晶體結(jié)構(gòu)（圖3-A～C），而突變體中復(fù)合淀粉顆粒變小，淀粉顆粒間疏松排列，存在較多單粒淀粉顆粒（圖3-D～F）。相應(yīng)地，與粉質(zhì)程度相對較輕的種背部分胚乳（圖3-A，D）相比，wrs1突變體發(fā)育胚乳的中部（圖3-B，E）與腹部（圖3-C，F(xiàn)）觀察到更明顯的造粉體發(fā)育遲滯。該結(jié)果表明，wrs1突變體中淀粉顆粒填充受到影響。

2.4 WRS1的圖位克隆

圖3 野生型和wrs1 突變體發(fā)育中的胚乳半薄切片觀察Fig.3.Semi-thin section analysis of developing endosperm of wild-type and thewrs1 mutant.

由于wrs1突變體純合致死，將wrs1雜合植株與粳稻滇粳優(yōu)1 號配組，從F2群體中挑選46 個(gè)具有粉質(zhì)胚乳表型的隱性極端個(gè)體，利用133 個(gè)覆蓋水稻12 條染色體的InDel 和SSR 多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析。初步將基因定位在第12 染色體長臂的3.7 Mb 區(qū)間內(nèi)，進(jìn)一步篩選了974 個(gè)極端個(gè)體并開發(fā)標(biāo)記將基因限定在183 kb 區(qū)間內(nèi)（圖4-A）。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，該區(qū)間內(nèi)有16 個(gè)開放讀碼框（open reading frames, ORFs）。進(jìn)一步測序發(fā)現(xiàn)wrs1突變體在基因Os12g0540900的第6 外顯子上存在一個(gè)SNP（由G 變成T），導(dǎo)致甲硫氨酸（Met）被異亮氨酸（Ile）替換（圖4-B）。Os12g0540900基因編碼區(qū)序列全長1227 bp，編碼一個(gè)色氨酰-tRNA 合成酶（WRS1）。

為驗(yàn)證Os12g0540900是目的基因，構(gòu)建了由花椰菜花葉病毒的35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)WRS1編碼區(qū)的pCAMBIA1305.1-WRS1-GFP 載體，轉(zhuǎn)化wrs1突變體愈傷。提取T0代轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性PCR 檢測（圖4-C），進(jìn)一步測序確認(rèn)轉(zhuǎn)基因陽性家系基因組序列中Os12g0540900基因型與突變體一致，且植株能正常生長、種子表型恢復(fù)透明（圖4-D）。因此，突變的Os12g0540900確實(shí)是導(dǎo)致wrs1表型的基因。

WRS1基因編碼一個(gè)具有471 個(gè)氨基酸的蛋白，進(jìn)化樹分析顯示該蛋白在真核生物中廣泛存在（圖5-A），具有一個(gè)高度保守的核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族的催化核心結(jié)構(gòu)域，其中包含Ⅰ類氨酰-tRNA 合成酶特有的HIGH 和KMSKS 基序（圖5-B）[20-21]，wrs1突變位點(diǎn)是核心結(jié)構(gòu)域的保守位點(diǎn)（圖5-C）。

2.5 WRS1的表達(dá)模式分析

為探究WRS1在各器官中的表達(dá)，利用qRT-PCR 進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其在植株中呈組成型表達(dá)，且在發(fā)育的胚乳中有較高的表達(dá)量（圖6-A）。同時(shí)，構(gòu)建了WRS1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β-葡萄糖苷酸酶基因（β-glucuronidase，GUS）表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化到日本晴中。對陽性轉(zhuǎn)基因植株不同組織的GUS 染色發(fā)現(xiàn)，WRS1在根、莖、葉、鞘、穗中均有一定表達(dá)，在發(fā)育種子中表達(dá)量最高（圖6-B）。

圖4 WRS1的圖位克隆Fig.4.Map-based cloning ofWRS1.

為確定WRS1 的亞細(xì)胞定位，分別構(gòu)建了WRS1 的C 端融合綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標(biāo)簽與N 端融合GFP 標(biāo)簽的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中觀察熒光信號，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)載體的GFP 熒光信號均彌散在細(xì)胞質(zhì)中（圖6-C）。因此，WRS1 是一個(gè)胞質(zhì)定位的蛋白。

2.6 淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)分析

由于wrs1突變體成熟種子腹部粉質(zhì)皺縮，具有明顯的淀粉合成缺陷表型，因此，利用qRT-PCR比較N22 與wrs1突變體發(fā)育12 d 胚乳中淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示突變體中大部分基因表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)（圖7-A）。隨后通過Western blotting 對成熟籽粒中部分淀粉合成酶的蛋白水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示突變體胚乳中GBSSⅠ蛋白水平上升，PHOⅠ、FLO4 蛋白水平較野生型明顯下調(diào)表達(dá)，BEⅠ、BEⅡb、SSⅢa 蛋白水平略微下降（圖7-B）。因此，推測WRS1突變導(dǎo)致淀粉合成途徑產(chǎn)生缺陷，導(dǎo)致淀粉含量降低，復(fù)合淀粉顆粒減少（圖2-A，圖3），形成胚乳皺縮表型。

2.7 WRS1基因突變影響氨基酸穩(wěn)態(tài)

氨酰-tRNA 合成酶在維持蛋白質(zhì)合成與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用[28]。比較野生型和wrs1成熟籽粒的蛋白含量，wrs1中平均每粒糙米蛋白含量降低7.35%（圖8-A），暗示基因的突變可能影響了種子中蛋白的合成。進(jìn)一步對野生型N22 和wrs1突變體中游離氨基酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示wrs1突變體中游離氨基酸總量極顯著增加，各類游離氨基酸含量均顯著增加，其相對含量也表現(xiàn)出不同的變化（圖8-B～D）?；谏鲜鼋Y(jié)果，說明wrs1突變體籽粒中蛋白質(zhì)合成量減少，氨基酸穩(wěn)態(tài)受到破壞。

圖5 WRS1 與其同源蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化樹分析Fig.5.Structure and phylogenetic analysis of WRS1 protein and its homologs.

圖6 WRS1的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位Fig.6.Expression pattern and subcellular localization ofWRS1.

圖7 淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)及淀粉合成酶蛋白的積累Fig.7.Expression and immunoblotting analyses of starch synthesis-related genes.

圖8 wrs1突變體的蛋白含量與游離氨基酸含量Fig.8.Contents of protein and free amino acids inwrs1.

3 討論

本研究通過篩選EMS 處理的N22 突變體庫發(fā)現(xiàn)一個(gè)籽粒腹部粉質(zhì)皺縮突變體wrs1。與野生型N22 相比，wrs1成熟種子橫斷面中央和腹部區(qū)域呈現(xiàn)粉質(zhì)。掃描電鏡顯示，wrs1中淀粉顆粒變圓且排列松散，這種變化在種子中央和腹部區(qū)域尤其顯著。進(jìn)一步半薄切片觀察到開花后8 d 的細(xì)胞中造粉體數(shù)目較少，且呈現(xiàn)出較疏松的結(jié)構(gòu)。此外，wrs1成熟種子千粒重及淀粉含量顯著下降，淀粉黏度特性、尿素溶液的溶解特性發(fā)生顯著變化。基于上述結(jié)果，可以認(rèn)為wrs1胚乳中存在淀粉發(fā)育缺陷的現(xiàn)象，wrs1是一個(gè)新的水稻胚乳發(fā)育異常突變體。

通過構(gòu)建突變體wrs1與粳稻品種滇粳優(yōu)1 號的F2定位群體，我們利用圖位克隆將該突變基因定位在第12 染色體的長臂標(biāo)記N56-32 與N56-39 之間約183 kb 區(qū)間內(nèi)，其中包含16 個(gè)預(yù)測的開放閱讀框?；驕y序發(fā)現(xiàn)Os12g0540900基因的第6 個(gè)外顯子上存在單堿基突變，導(dǎo)致甲硫氨酸（Met）被異亮氨酸（Ile）替換。構(gòu)建由花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)WRS1全長CDS的pCAMBIA1305.1-WRS1-GFP 載體并侵染wrs1突變體的愈傷組織，轉(zhuǎn)基因陽性家系種子表型恢復(fù)透明。由此證實(shí)了Os12g0540900確實(shí)是導(dǎo)致wrs1表型的基因。WRS1在植物體中組成型表達(dá)，且胚乳中表達(dá)量較高。我們利用qRT-PCR 比較了野生型與突變體中這些淀粉合成關(guān)鍵基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大部分淀粉合成相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，檢測部分重要的淀粉合成酶蛋白積累情況，其在野生型和突變體中所呈現(xiàn)的差異與基因表達(dá)水平的差異并不完全一致。由此認(rèn)為wrs1中的籽粒表型和理化性質(zhì)變化可能歸因于WRS1基因間接影響多個(gè)水稻淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)的聯(lián)合效應(yīng)。另外，對成熟籽粒蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量進(jìn)行測定，突變體wrs1蛋白含量顯著降低，游離氨基酸含量極顯著上升。綜合以上結(jié)果，WRS1編碼一個(gè)影響水稻種子胚乳發(fā)育的關(guān)鍵基因，且WRS1可能通過影響到蛋白合成和體內(nèi)氨基酸穩(wěn)態(tài)而間接影響到胚乳的發(fā)育。

WRS 屬于Ic 類aaRSs 家族，含有一個(gè)RF 結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)高度保守基序，其中KMSKS 基序用于促進(jìn)氨基酸活化，HIGH 基序負(fù)責(zé)氨基酸活化過程中穩(wěn)定ATP，并在tRNA 的3′端穩(wěn)定氨基酸轉(zhuǎn)移，此外，還有C 末端的α 螺旋結(jié)構(gòu)域作為tRNA 反密碼子的結(jié)合位點(diǎn)。本研究克隆到了植物中的WRS基因，同源蛋白序列比對顯示，WRS1 具有上述Ic類aaRSs 家族承擔(dān)核酸到蛋白質(zhì)的信息轉(zhuǎn)化功能的保守結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，水稻W(wǎng)RS1 是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)定位的蛋白，由于植物的蛋白質(zhì)合成在胞質(zhì)、葉綠體、線粒體三個(gè)細(xì)胞區(qū)室中發(fā)生，因此水稻中還存在著其他WRS基因維持葉綠體和線粒體中的蛋白正常合成。同源比對發(fā)現(xiàn)，基因Os01g0743400編碼的WRS2 與擬南芥中葉綠體和線粒體雙定位的TrpRS（At2g25840編碼）[22]高度同源?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測WRS1 主要負(fù)責(zé)胞質(zhì)中的蛋白合成，而WRS2 負(fù)責(zé)葉綠體和線粒體的蛋白質(zhì)合成。蛋白合成是一個(gè)復(fù)雜而精密的過程，線性遺傳信息被解碼成蛋白質(zhì)，這種大分子對幾乎所有的生物途徑都有貢獻(xiàn)[38]。在這期間aaRSs 協(xié)助tRNA 結(jié)合對應(yīng)氨基酸，完成對mRNA 鏈的解讀。多肽鏈在核糖體上被合成之后轉(zhuǎn)運(yùn)往內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體進(jìn)一步折疊和修飾。目前已報(bào)道的蛋白合成突變體如核糖體大亞基蛋白3B 突變體rml1[39]、真核翻譯延伸因子eEF1A 突變體spl33[40]的研究中未見胚乳淀粉合成缺陷的表型。另外，植物中aaRSs參與配子發(fā)生與胚發(fā)育[28]、莖分生組織發(fā)育[33]、質(zhì)體的早期發(fā)育[31]及免疫信號的感知與病害防御[34]等生物學(xué)過程已有相關(guān)研究，足以說明該家族蛋白對植物生長發(fā)育進(jìn)程中的多方面造成影響。目前有關(guān)色氨酰-tRNA 合成酶功能研究的報(bào)道主要是以高等動(dòng)物為對象，其功能的延展涉及蛋白域特異性結(jié)合、激酶抑制劑活性、蛋白同源二聚化等，并且有證據(jù)顯示這些功能與脊椎動(dòng)物特有的WHEP 結(jié)構(gòu)域關(guān)系密切[21,41-42]。本研究在植物中克隆到WRS1基因，該基因缺乏WHEP 結(jié)構(gòu)域，但從其特殊的胚乳缺陷表型來說，植物中WRS 蛋白可能存在的多功能性還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，色氨酰-tRNA 合成酶WRS1 的突變影響了細(xì)胞的蛋白翻譯系統(tǒng)，打破了游離氨基酸的穩(wěn)態(tài)，影響了蛋白的合成和淀粉的積累，導(dǎo)致胚乳發(fā)育和幼苗生長嚴(yán)重受阻，WRS1對水稻種子發(fā)育與植株的生長至關(guān)重要。

謝辭：感謝農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心對本研究給予資助。本項(xiàng)目還受到江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金[CX(19)1002]和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（KYTZ201601）等項(xiàng)目的資助。