肖 權(quán)，徐長明，王永超，周 全

0 引 言

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)嚴(yán)重危害公眾健康[1]。干細(xì)胞移植是有效的治療手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)能與髓核細(xì)胞直接接觸亦能通過旁分泌促進髓核細(xì)胞增殖[2]。外泌體是旁分泌的主要介質(zhì)，是具有生物學(xué)活性的微囊泡[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可通過提送外泌體抑制髓核細(xì)胞凋亡緩解IDD[5]，但關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體(bone mesenchymal stem cell-derived exosomes，BMSC-Exo)抑制髓核細(xì)胞凋亡的機制尚不清楚。本研究擬探討B(tài)MSC-Exo調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的可能機制，為IDD治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級雄性6～8周大鼠8只，體重(200±20)g，購于徐州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：XZXK(蘇)2019-0003，合格證號：201902056，實驗大鼠采取光晝交替(光照時間：07：00-18:00)，溫度25 ℃左右，濕度50%左右，通風(fēng)良好，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實驗研究經(jīng)過徐州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20190126)。

1.1.2 主要實驗試劑伊思柯夫改良培養(yǎng)液(IMDM)、F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(gibco)；成骨/成脂/成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(蘇州賽業(yè))；Ⅱ型膠原酶、內(nèi)毒素、二硫氨基甲酸肽吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)、佛波醇酯、聚乙二醇辛基苯基醚(triton-X100)、Tween(Sigma) ；兔抗鼠Ⅱ型膠原、Cleaved Caspase-3、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)、β-actin抗體(Sigma)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德)；ECL試劑盒、PKH67染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-APC/PI凋亡檢測試劑盒、DAPI染色液 (北京百奧萊博)；兔抗鼠CD105/44/29/90/63/9、GAPDH和TSG101抗體(BD Biosciences)；RIPA裂解液 (江蘇碧云天)。

1.1.3 主要實驗儀器高速臺式離心機(SKFH-1600RW，湖南湘儀)；超高速離心機(L-90K，Beckman)；熒光倒置顯微鏡(NIB900-FL，Olympus)；透射電鏡(832.10w，北京京科瑞達(dá))；Western blot檢測裝置(125-0098，Bio-Rad)；酶標(biāo)儀器(HBS-1096A，上海研卉)；流式細(xì)胞儀(EpicsAltra，Beckman Coulter)；納米顆粒跟蹤分析儀(Nanosight NS300，Malvern)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物取材大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后拉頸處死，無菌條件下分離取出股骨、脛骨及尾椎髓核。

1.2.2 BMSCs的分離培養(yǎng)剪去股骨脛骨兩端，無血清培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，并吹打成單細(xì)胞懸液。4 ℃離心半徑18 cm，1000 r/ min離心4 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，靜置2 min。4 ℃離心半徑18 cm，1000 r/ min離心4 min，棄上清。PBS洗滌2次。10%FBS的IMDM10 mL重懸，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、5% CO2及飽和濕度)靜置培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后每2～3天換液1次。細(xì)胞長至80%～90%時消化傳代。本實驗中所用BMSCs均為P4代。

1.2.3 BMSCs的三系誘導(dǎo)分化鑒定取P4代BMSCs按6孔板5×104/孔密度接種，分為成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)。成脂誘導(dǎo)：細(xì)胞完全融合后交替使用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液和B液誘導(dǎo)，3周后視情況油紅O染色。成骨誘導(dǎo)：細(xì)胞融合至70%時加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d換液1次，3周后視情況茜素紅染色。成軟骨誘導(dǎo)：將4×105個BMSCs轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，250×g離心4 min，棄上清，加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，150×g離心5 min，擰松管蓋，靜置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3 d換液1次，3周視軟骨球形成情況包埋切片，阿藍(lán)利辛染色。

1.2.4 BMSC-Exo提取及鑒定P4代BMSCs長至80%時，換無血清IMDM培養(yǎng)48 h，收集上清后采用超高速離心法抽提外泌體：4 ℃，300×g離心10 min，保留上清液，繼續(xù)4 ℃，2000×g離心10 min，保留上清液，繼續(xù)4 ℃，10 000×g離心30 min，保留上清液，繼續(xù)4 ℃，100 000×g離心70 min，保留沉淀，加入100～200 μL PBS稀釋，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ干潆婄R觀察外泌體形態(tài)。Western blot檢測BMSCs和外泌體表面蛋白標(biāo)志物。納米顆粒跟蹤分析儀觀察外泌體顆粒直徑分布。

1.2.5 PKH67/DAPI免疫熒光染色檢測外泌體膜融合能力室溫避光下取PKH67染色試劑盒母液2 μL與稀釋液18 μL混合，再加入1×PBS 280 μL混勻，使PKH67母液250倍稀釋。加入蛋白定量為100 μg的BMSC-Exo，混勻后室溫孵育15 min。加入10 mL 1×PBS，再加入一半體積的外泌體提取試劑盒試劑，混勻，4 ℃靜置1 h，10 000×g離心30 min，沉淀用200 μL 1×PBS重懸，即得PKH67標(biāo)記的BMSC-Exo。將其與培養(yǎng)皿中貼壁的髓核細(xì)胞共孵48 h，多聚甲醛固定，PBST(1×PBS + 0.1% Triton X-100)洗3次，5 min/次。加3 mL1%BSA孵育30 min，PBST (1×PBS + 0.1% Tween)洗3次，5 min/次。加0.5 ug/mL DAPI染液3 mL，孵育5 min。PBST (1×PBS + 0.1% Tween)再洗3次，5 min/次。熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 髓核細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定剪碎髓核，Ⅱ型膠原酶消化90 min，濾去殘渣。4 ℃，離心半徑18 cm，1000 r/ min離心5 min。含10% FBS的F12培養(yǎng)基重懸，靜置培養(yǎng)，適時傳代。采用甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色進行鑒定。

1.2.7 CCK-8檢測髓核細(xì)胞活力將消化后的髓核細(xì)胞按照96孔板密度為：1×104/孔接種，細(xì)胞貼壁生長24 h后，采用不同濃度(0、100、200、500、1000 μg/mL)內(nèi)毒素處理24 h，每個濃度6重復(fù)，每孔加入CCK-8溶液10 μL繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀設(shè)定波長450 nm檢測各孔A值，以A值反映細(xì)胞活力。細(xì)胞成活率計算公式如下：

細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

As：實驗孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8內(nèi)毒素)A值；Ac：內(nèi)毒素濃度=0 μg/mL的細(xì)胞孔A值；Ab：空白孔(不含細(xì)胞和內(nèi)毒素的培養(yǎng)基、CCK-8)A值，本實驗中Ab=0.002。根據(jù)結(jié)果選擇合適濃度的內(nèi)毒素誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡。

1.2.8 檢測NF-κB信號通路抑制后髓核細(xì)胞凋亡率的變化將消化后的髓核細(xì)胞按照6孔板密度為1×105/孔接種并分組：內(nèi)毒素組、內(nèi)毒素+PDTC組，細(xì)胞貼壁生長24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS潤洗2次，分別加入內(nèi)毒素500 μg/mL、內(nèi)毒素500 μg/mL+PDTC 5 μmol/L各2 mL孵育24 h。流式細(xì)胞儀檢測凋亡：按分組予不同試劑培養(yǎng)24 h后收集髓核細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，室溫下采用Annexin V-FITC 和PI避光孵育15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)檢測結(jié)果分析計算凋亡率，3次重復(fù)的實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析得到總體細(xì)胞凋亡率。

1.2.9 檢測內(nèi)毒素、外泌體及NF-κB通路激活劑作用后髓核細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、p-IκBα蛋白的表達(dá)變化將消化后的髓核細(xì)胞按照6孔板密度為1×105/孔接種并分組：對照組、退變組、外泌體組、佛波醇酯組，細(xì)胞貼壁生長24 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS潤洗2次，分別加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液、內(nèi)毒素500 μg/mL、內(nèi)毒素500 μg/mL +外泌體20 μg、內(nèi)毒素500 μg/mL+外泌體20 μg+佛波醇酯50 μg/mL各2 mL孵育24 h。流式細(xì)胞儀檢測凋亡：方法同1.2.8。蛋白質(zhì)免疫印跡：收集各組髓核細(xì)胞加RIPA裂解，蛋白質(zhì)濃度定量，每孔上樣30 μg SDS-PAGE凝膠電泳，切膠、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗(Cleaved Caspase-3、p-IκBα、β-actin)、二抗，加ECL試劑曝光，計算各條帶灰度值，推算各組p-IκBα、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量。

a：原代BMSC細(xì)胞形態(tài)( ×100)；b：成脂誘導(dǎo)(油紅O染色 ×100)；c：成骨誘導(dǎo)(茜素紅染色 ×40)；d：成軟骨誘導(dǎo)(阿藍(lán)利辛染色 ×40)；e：電鏡下觀察BMSCs-Exo形態(tài)( ×50 000)圖1 BMSC原代培養(yǎng)、三系誘導(dǎo)分化染色光鏡下觀察結(jié)果及外泌體電鏡下觀察

2 結(jié) 果

2.1 BMSC-Exo提取與鑒定BMSCs均勻生長，呈長梭形。成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色見細(xì)胞內(nèi)有紅色球形脂滴形成；成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色見有黑色的鈣結(jié)節(jié)形成；成軟骨誘導(dǎo)分化形成小軟骨球，切片后阿藍(lán)利辛染色見淡藍(lán)色糖胺聚糖積累。電鏡下外泌體形態(tài)特征為杯托狀結(jié)構(gòu)。見圖1。Western blot檢測BMSCs特異性表達(dá)CD105、CD44、CD29、CD90，BMSCs-Exo表達(dá)CD63、CD9、TSG101，見圖2。納米顆粒跟蹤分析儀顯示外泌體直徑多分布在100 nm。外泌體PKH67染色發(fā)綠色熒光，髓核細(xì)胞細(xì)胞核DAPI染色發(fā)藍(lán)色熒光，共孵后外泌體在髓核細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)綠色熒光，說明外泌體具有膜融合能力，可被髓核細(xì)胞攝取。見圖3。

圖2 Western blot檢測外泌體以及BMSCs標(biāo)志蛋白表達(dá)情況

a：納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體顆粒直徑；b：DAPI；c：PKH67；d：共同顯示圖3 納米顆粒跟蹤分析儀及免疫熒光染色檢測外泌體結(jié)果( ×200)

2.2 髓核細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定原代髓核細(xì)胞培養(yǎng)14 d，形態(tài)轉(zhuǎn)為長梭形，內(nèi)含分泌顆粒。甲苯胺藍(lán)染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞外基質(zhì)色稍淺，表明細(xì)胞可分泌糖胺多糖。Ⅱ型膠原免疫化學(xué)染色見細(xì)胞外基質(zhì)被染成棕黃色，表明細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。見圖4。

a：髓核細(xì)胞在光鏡下形態(tài)特征；b：髓核細(xì)胞(甲苯胺藍(lán)染色)；c：髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原(免疫組化染色)圖4 髓核細(xì)胞鏡下形態(tài)及相關(guān)染色情況( ×40)

2.3 內(nèi)毒素對髓核細(xì)胞細(xì)胞活力的影響CCK-8實驗結(jié)果結(jié)果顯示：相比于內(nèi)毒素濃度0 μg/mL處理的細(xì)胞孔，其余各濃度的A值普遍降低，細(xì)胞存活率普遍下降(P<0.01)，各處理濃度下細(xì)胞存活率相對差異較大(F=383.8，P<0.0001)，見表1。由于500 μg/mL與1000 μg/mL處理后細(xì)胞存活率數(shù)值較為接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.491，t=1.005，P=0.339)，因此后續(xù)研究中采用內(nèi)毒素500 μg/mL濃度處理髓核細(xì)胞建立凋亡模型。

表1 CCK8檢測不同濃度內(nèi)毒素對髓核細(xì)胞A值及細(xì)胞存活率的影響

2.4 內(nèi)毒素誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡涉及NF-κB通路內(nèi)毒素+PDTC組細(xì)胞凋亡率[(11.55±0.86)%]較內(nèi)毒素組[(28.63±2.86)%]明顯降低(t=9.909，P=0.001)，PDTC抑制了NF-κB信號通路后內(nèi)毒素誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡效率明顯降低，這說明髓核細(xì)胞凋亡涉及NF-κB通路。見圖5。

a：內(nèi)毒素組；b：內(nèi)毒素+PDTC組

2.5 BMSC-Exo通過抑制NF-κB通路抑制髓核細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測的對照組凋亡率為(9.05±1.61)%，而退變組髓核細(xì)胞凋亡率升高至(29.48±2.83)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-10.874，P=0.000)；與退變組相比，外泌體組髓核細(xì)胞凋亡率下降至(15.08±1.65)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.620，P=0.002)；與外泌體組相比，佛波醇酯組髓核細(xì)胞凋亡率增加至(25.41±1.38)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.323，P=0.001)。見圖6。與對照組比較，退變組p-IκBα蛋白表達(dá)升高(t=-10.575，P=0.000)，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高(t=-8.506，P=0.001)；與退變組比較，外泌體組p-IκBα蛋白表達(dá)降低(t=10.052，P=0.001)，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)降低(t=7.419，P=0.002)；與外泌體組比較，佛波醇酯組p-IκBα蛋白表達(dá)升高(t=-12.125，P=0.000)，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高(t=-8.421，P=0.001)。見圖7。

a:對照組; b:退變組; c:外泌體組; d:佛波醇酯組圖6 流式細(xì)胞儀檢測髓核細(xì)胞凋亡情況

與對照組比較，*P<0.05；與退變組比較，#P<0.05；與外泌體組比較，△P<0.05圖7 Western blot檢測各組p-IκBα、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

IDD機制尚不清楚，目前認(rèn)為與髓核細(xì)胞炎癥密切相關(guān)，炎癥因子在其中發(fā)揮重要作用[6-7]。NF-κB是炎癥因子的上游調(diào)控因子，研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB活性可抑制炎癥因子產(chǎn)生[8]。亦有研究發(fā)現(xiàn)退變椎間盤組織NF-κB含量較正常明顯增高[9]，NF-κB通路抑制后，IDD明顯減緩[10-11]。內(nèi)毒素可通過活化NF-κB通路促進細(xì)胞凋亡[12]。PDTC是體外NF-κB通路研究常用的阻斷劑，它能抑制IκBα磷酸化，阻止NF-κB入核，從而發(fā)揮通路阻斷作用。因此，本研究采用內(nèi)毒素作為誘導(dǎo)介質(zhì)，建立髓核細(xì)胞細(xì)胞凋亡模型，加入PDCT作用于髓核凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞凋亡率明顯下降，說明細(xì)胞凋亡確有NF-κB信號通路參與。

Caspase-3是執(zhí)行凋亡的關(guān)鍵分子，作為Caspase-3的活化形式，Cleaved Caspase-3是細(xì)胞凋亡進入不可逆階段的標(biāo)志[13]。NF-κB蛋白二聚體與IκBα結(jié)合形成三聚體而失活存在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞收到激活信號后IκBα磷酸化從三聚體分離，而二聚體轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[14]。因此IκBα的磷酸化(p-IκBα)是NF-κB信號通路活化的重要標(biāo)志[15]。本研究用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率發(fā)現(xiàn)PDTC抑制NF-κB通路后，髓核細(xì)胞凋亡率明顯下降，Western blot檢測顯示Cleaved Caspase-3和p-IκBα蛋白均明顯下降，可見PDTC抑制了NK-κB信號通路，該通路與髓核細(xì)胞退變密切相關(guān)。

內(nèi)毒素是人體中一種重要的促炎因子，它可誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生強烈炎癥導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，減少髓核細(xì)胞外細(xì)胞基質(zhì)合成，在IDD過程中發(fā)揮重要作用[12]。本研究CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)隨著內(nèi)毒素濃度的增加A值逐步降低，而A值與細(xì)胞存活率呈正相關(guān)，并且內(nèi)毒素500 μg/mL和1000 μg/mL處理組之間A值沒有顯著差異，因此我們選擇內(nèi)毒素500 μg/mL濃度建立髓核細(xì)胞凋亡模型。采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果均顯示內(nèi)毒素有效誘導(dǎo)了髓核細(xì)胞凋亡。

外泌體是40～100 nm大小的微囊泡，內(nèi)含生物活性物質(zhì)[16]。研究表明，外泌體在細(xì)胞通訊和代謝調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[17]。BMSC-Exo可抑制炎癥介質(zhì)激活減少髓核細(xì)胞凋亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體達(dá)到有效治療作用的最低劑量是10～100 μg[19],因此本實驗選擇20μg作為外泌體的實驗劑量。外泌體分離方法主要有超速離心法、聚合物沉淀法、超濾法、免疫親和法、顯微射流分離技術(shù)等，超速離心法是“金標(biāo)準(zhǔn)”，使用最廣泛[20]。本研究中即用該方法提取外泌體。國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會規(guī)定外泌體的鑒定必須包括粒徑大小、形態(tài)以及蛋白分子標(biāo)記等三方面[19]。本研究通過納米顆粒跟蹤分析儀觀察粒徑大小、透射電鏡觀察形態(tài)及免疫印跡檢測表面標(biāo)志物對所提取的外泌體進行鑒定，同時通過免疫熒光檢測證實其確實能被髓核細(xì)胞攝取。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)外泌體組的髓核細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示BMSC-Exo可被髓核細(xì)胞攝取并減輕其凋亡。

為研究BMSC-Exo對髓核細(xì)胞的抗凋亡機制，本研究采用NF-κB通路經(jīng)典激活劑佛波醇酯，佛波醇酯可使IκBα磷酸化，促使NF-κB入核，從而活化NF-κB信號通路。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，外泌體組可以抑制內(nèi)毒素導(dǎo)致的髓核細(xì)胞凋亡，而使用佛波醇酯激活NF-κB信號通路后，髓核細(xì)胞凋亡率升高，Western blot檢測顯示Cleaved Caspase-3和p-IκBα蛋白均明顯升高，提示NK-κB信號通路被佛波醇酯激活，并且該信號通路激活后外泌體的抗凋亡作用基本被逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，BMSC-Exo可以通過調(diào)控NF-κB信號通路抑制髓核細(xì)胞凋亡。以上研究初步揭示了BMSCs對髓核細(xì)胞凋亡的作用機制，為IDD的治療提供了新思路。