孫思琦 甕岳太 邸雪穎 劉志華 楊 光

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營(yíng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150040)

森林地表可燃物的自然分解過(guò)程緩慢，導(dǎo)致林內(nèi)物質(zhì)積累，氣候干燥時(shí)造成森林火災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)(Nakayamaetal., 2001)，使森林防火難度增大。纖維素是森林可燃物的主要組分，在很大程度上控制著森林可燃物的分解過(guò)程(Steffenetal., 2007； Yueetal., 2016)。溫帶森林地表可燃物的分解主要受真菌活動(dòng)影響(Watlingetal., 1998； Hattenschwileretal., 2005)。真菌可通過(guò)自身分泌的酶將其他微生物不能分解的纖維素等高分子化合物分解為簡(jiǎn)單的小分子化合物，因而能加速森林地表可燃物分解過(guò)程(Kj?lleretal., 1982； Djarwantoetal., 2009)。篩選并應(yīng)用纖維素高效降解真菌，使其分解地表可燃物中不易分解的纖維素組分，減少森林可燃物載量，可達(dá)到降低森林火險(xiǎn)等級(jí)的目的。然而，能完全降解森林地表可燃物等含纖維素類物質(zhì)的高活性菌株十分缺乏，且具有高纖維素酶活性的菌株對(duì)枯枝落葉的分解能力不一定強(qiáng)(Kwonetal., 1996)。因此，為了采取生物防火措施在一定程度上降低森林可燃物載量，分離篩選能有效降解地表可燃物中纖維素的菌種十分必要。

Djarwanto等(2009)在印度尼西亞南蘇門答臘島的相思樹(shù)(Acaciamangium)人工林內(nèi)，采集真菌的子實(shí)體和有菌絲附著的地表可燃物，從中分離篩選出6株真菌，然后以相思樹(shù)木屑為分解基質(zhì)進(jìn)行了基于木質(zhì)素和綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降解試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選出層菌綱(Hymenoycetes)非褶菌目(Polyporales)Polyporussp.為降解相思樹(shù)木屑中木質(zhì)素和綜纖維素的最有效菌種； Boberg等(2011)從針葉林地表可燃物中分離得到9株真菌，測(cè)試了其降解歐洲赤松(Pinussylvestris)針葉的能力，其中盤菌綱(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)的Chalaralongipes及其他3個(gè)菌株、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)的鎖瑚菌屬(Clavulina)/肉片齒菌屬(Sistotrema)可降解纖維素，松針散斑殼(Lophodermiumpinastri)[斑痣盤菌目(Rhytismatales)]極易分解纖維素，并可造成木質(zhì)素的大量損失。

帽兒山地區(qū)地處中溫帶，溫度濕度較低，森林地表可燃物的分解受到很大制約。本研究篩選帽兒山地區(qū)闊葉與針葉人工林地表可燃物中的纖維素高效降解真菌，進(jìn)行了可燃物樣品降解試驗(yàn)并分析其降解效果，可為制定森林可燃物合理管理策略提供科學(xué)依據(jù)，并為應(yīng)用生物降解方法降低森林地表可燃物載量提供新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 室內(nèi)降解可燃物樣品采自帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)尖砬溝森林培育實(shí)驗(yàn)站的興安落葉松(Larixgemelinii)、胡桃楸(Juglansmandshurica)、水曲柳(Fraxinusmandshurica)、紅皮云杉(Piceakoraiensis)林內(nèi)的未分解層(L層，Litter)、半分解層(F層，F(xiàn)ermentative layer)和全分解層(H層，Humus horizon)(Cookeetal., 1984)。野外降解可燃物樣品為采自胡桃楸、興安落葉松以及胡桃楸×興安落葉松混交林內(nèi)的凋落葉。

1.1.2 培養(yǎng)基 孟加拉紅培養(yǎng)基(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)瓊脂培養(yǎng)基(黃秀梨，1999)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基和麥芽浸粉液體培養(yǎng)基： 麥芽浸粉20 g，吐溫800.5 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離與篩選 將各層樣品分別置于盛有無(wú)菌水的三角瓶?jī)?nèi)，于200 r·min-1的搖床上振蕩20 min混勻，將母液按10、20、30倍稀釋成系列濃度梯度，用移液槍吸取0.2 mL涂布到孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7天。之后分別挑取各菌落邊緣的菌絲至PDA培養(yǎng)基平板上，反復(fù)接種進(jìn)行分離純化，直至獲得純菌株。

采用剛果紅染色法在CMC-Na培養(yǎng)基上篩選纖維素降解菌(Dingetal., 1999)。將已純化的菌株呈品字形接種于CMC-Na培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌種在平板上長(zhǎng)出可見(jiàn)菌落后，向培養(yǎng)基中加入0.2%的剛果紅試劑2 mL進(jìn)行染色，輕輕搖動(dòng)，使試劑鋪滿整個(gè)平板，放置15 min后，將剛果紅試劑倒去。再加入0.5%的NaCl溶液2 mL進(jìn)行脫色，輕輕搖動(dòng)，使NaCl溶液鋪滿培養(yǎng)基表面，放置15 min，再將NaCl溶液倒去。若菌落周圍出現(xiàn)透明水解圈則該菌株可產(chǎn)生纖維素酶，水解圈越大則產(chǎn)生的纖維素酶活性越強(qiáng)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量水解圈與菌落直徑大小，用以下公式計(jì)算各菌株的纖維素分解指數(shù)，通過(guò)比較得到高活性纖維素酶菌株：

1.2.2 纖維素降解菌的鑒定 將按上述步驟篩選出的高活性纖維素酶菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天，直至獲得大量成熟孢子。首先，挑取有孢子的菌塊于蓋玻片上，放在載玻片上進(jìn)行鏡檢，根據(jù)產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形狀特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定； 其次，對(duì)其ITS序列進(jìn)行DNA測(cè)序，通過(guò)將測(cè)序得到的ITS序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知真菌ITS序列進(jìn)行比較，從而獲得種屬信息，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 地表可燃物室內(nèi)降解試驗(yàn) 將1.1.1中于興安落葉松與胡桃楸林內(nèi)未分解層收集的針葉可燃物裁成2 cm大小片段，闊葉可燃物裁成1 cm×1cm碎塊，65 ℃條件下烘干至恒重。放入裝有10 mL已滅菌的麥芽浸汁液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶?jī)?nèi)，每瓶放0.8 g可燃物作為分解基質(zhì)，該分解基質(zhì)分為3種類型，即針葉分解基質(zhì)(每瓶0.8 g針葉可燃物)、闊葉分解基質(zhì)(每瓶0.8 g闊葉可燃物)和針闊葉混合分解基質(zhì)(每瓶0.4 g針葉可燃物和0.4 g闊葉可燃物)。

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)純培養(yǎng)的高活性纖維素酶菌株平板，用已滅菌的打孔器(外徑6 mm)在菌絲生長(zhǎng)旺盛區(qū)域制取菌餅20個(gè)，將菌餅接入裝有100 mL滅菌水的三角瓶，于28 ℃、160 r·min-1下恒溫振蕩培養(yǎng)7天，于4 000 r·min-1下離心10 min，上清液即為高活性纖維素酶菌株的菌懸液。將不同菌株的菌懸液分別接入裝有3類分解基質(zhì)的三角瓶，每瓶接種量均為300 μL，置于人工培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度25 ℃、濕度80%、無(wú)光照)。于裝有3類分解基質(zhì)的三角瓶中加入300 μL滅菌水作為對(duì)照處理，其他培養(yǎng)條件同前。降解試驗(yàn)持續(xù)80天，每隔20天取樣1次，共取樣4次，每次每種處理每種基質(zhì)取樣3瓶，共288瓶。

用鑷子將經(jīng)降解后的可燃物小心取出，置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，往培養(yǎng)皿中加入無(wú)菌水，多次漂洗可燃物，并用鑷子將菌絲與調(diào)落物分離。處理后的可燃物樣品放入65 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過(guò)40目篩備用。

1.2.4 野外降解樣地設(shè)置 在帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的胡桃楸、興安落葉松以及胡桃楸×興安落葉松混交林內(nèi)，各設(shè)置3個(gè)20 m×20 m的標(biāo)準(zhǔn)地，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)地內(nèi)隨機(jī)設(shè)置9個(gè)1 m×1m的小樣方，作為降解試驗(yàn)點(diǎn)。

1.2.5 地表可燃物野外降解試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取采回的凋落葉10 g，裝進(jìn)大小為15 cm×10 cm、孔徑90目的尼龍凋落物袋中，3種林型各裝540袋，共1 620袋，并用記號(hào)筆在凋落物袋上標(biāo)記林型與樣品號(hào)，稱重并記錄每袋樣品初始質(zhì)量。在設(shè)置好的每個(gè)小樣方內(nèi)各放置對(duì)應(yīng)林型的18袋可燃物，另將不作任何處理的對(duì)照凋落物袋按林型隨機(jī)放置在不同小樣方內(nèi)。

選取經(jīng)1.2.3篩選出的2株纖維素高效降解真菌A4[緊密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)]與A2[肉色隔孢伏革菌(Peniophoraintranata)]作為野外降解試驗(yàn)供試菌種。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)打開(kāi)純培養(yǎng)的供試菌株平板，用已滅菌的打孔器(外徑6 mm)在菌絲生長(zhǎng)旺盛區(qū)域制取菌餅，將40個(gè)菌餅接入裝有400 mL添加了吐溫80的麥芽浸粉培養(yǎng)基(Leeetal., 2015)的1 000 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r·min-1下恒溫振蕩培養(yǎng)5天，用滅菌的8層紗布過(guò)濾，得到2種供試菌種的菌懸液，設(shè)置低、中、高3種劑量分別為50、200和400 mL。混合菌劑為2種菌懸液等體積混合，劑量同上。為方便描述，菌株A2、菌株A4以及2菌株混合制得菌劑分別記為菌劑A、菌劑B、菌劑C。將制備好的3種降解劑分別裝瓶備用。3種不同劑型(菌劑A、菌劑B、菌劑C)、3種劑量(低、中、高)將不同菌劑對(duì)應(yīng)噴灑到設(shè)置好的9個(gè)小樣方內(nèi)裝有可燃物的凋落物袋上，噴灑需盡量均勻，使袋內(nèi)可燃物均能接觸到菌劑。3種林型的每塊標(biāo)準(zhǔn)地均作相同處理。

于噴灑后每月分別采集經(jīng)菌劑處理和未作處理(對(duì)照)的凋落物袋，帶回實(shí)驗(yàn)室，于80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量后將可燃物粉碎，過(guò)40目篩備用。

1.2.6 綜纖維素(纖維素與半纖維素)含量測(cè)定 采用纖維測(cè)定儀，根據(jù)Van Soest(1963)的方法，測(cè)定綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。精確稱取1 g(記為m)樣品，放入裝有灰化后的硅藻土的坩堝(40～100 μm)中。用中性洗滌劑(3%十二烷基硫酸鈉溶液)在消煮管中加熱消煮60 min。經(jīng)消煮后，殘?jiān)砂肜w維素、纖維素、木質(zhì)素和硅酸鹽組成，干燥后稱質(zhì)量記為A。樣品再用酸性洗滌劑(2%十六烷基三甲基溴化銨溶液)消煮60 min，剩余物為纖維素、木質(zhì)素和硅酸鹽。樣品在室溫下用12 mol·L-1硫酸消解，剩余物干燥后稱質(zhì)量記為B，為木質(zhì)素和硅酸鹽。隨后于550 ℃馬弗爐中灰化2 h。冷卻至室溫后，剩余物稱質(zhì)量記為C，即硅酸鹽的質(zhì)量。

(1)

綜纖維素降解率=(C0-Ct)/C0×100%。

(2)

式中：C0為初始綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Ct為降解后綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.7 掃描電鏡觀察 借助掃描電鏡，觀察地表可燃物不同降解階段的真菌生長(zhǎng)情況。隨機(jī)選取經(jīng)高活性纖維素酶菌株培養(yǎng)后的可燃物葉片，自然干燥后用解剖刀片取小塊，并切開(kāi)葉片露出縱切面，將其粘在掃描電鏡樣品盤上。采用離子濺射儀對(duì)樣品表層進(jìn)行噴金處理，利用日本電子JSM-7500F掃描電鏡對(duì)葉片樣品進(jìn)行觀察和分析。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016和Origin 2018軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算與作圖； 利用單因素方差分析Student-Newman-Keuls(SNK)多重比較法分析闊葉、針葉及混交基質(zhì)經(jīng)不同菌株處理后綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及綜纖維素降解率的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離與篩選

孟加拉紅培養(yǎng)基中含有氯霉素，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有抑制作用。根據(jù)不同的菌落形態(tài)，用孟加拉紅培養(yǎng)基分離出約15個(gè)菌株。其中，來(lái)自云杉人工林4株、水曲柳6株、興安落葉松2株以及胡桃楸3株，分別記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、B5、B6、C1、C2、D1、D2和D3。

15株真菌均在CMC-Na培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)染色和脫色后，菌落周圍水解圈的大小因菌種而異。8個(gè)菌株的水解圈比較明顯(圖1)，分別為A2、A3、A4、B2、B4、B6、D2和D3。表1列出了菌落直徑與水解圈直徑的測(cè)量結(jié)果，水解圈直徑在5.24～13.43 mm之間。水解圈顯示了這些真菌產(chǎn)生的纖維素酶的活性并且表明真菌本身能夠降解纖維素。8個(gè)菌株的纖維素分解指數(shù)在1.89～3.19之間。其中，菌株B2的纖維素分解指數(shù)顯著高于其他供試菌株(P<0.05)，說(shuō)明菌株B2產(chǎn)酶潛力最大。以上8個(gè)分離株用于進(jìn)一步的篩選。

圖1 真菌菌落和水解圈在CMC-Na培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

表1 菌落和水解圈直徑測(cè)量結(jié)果①

2.2 纖維素降解菌的鑒定

將8株菌的ITS序列與Genbank中的模式菌株及親緣關(guān)系較近的菌株進(jìn)行序列比對(duì)，用非加權(quán)組平均法(UPGMA法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將B2、A4、A3、A2、D2、B4、C2、D3分別鑒定為枝細(xì)枝孢、緊密帚枝霉、Pleosporales sp.、肉色隔孢伏革菌、Fungal sp.、臭曲霉、Dothideomycetes sp.和灰黃青霉。

2.3 地表可燃物室內(nèi)降解

由圖3可知，在整個(gè)室內(nèi)降解試驗(yàn)期間，分解基質(zhì)中綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨天數(shù)增加呈下降趨勢(shì)。闊葉基質(zhì)初始綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.4%。降解試驗(yàn)持續(xù)20天后，綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)菌種的不同下降到28.0%～29.5%，與對(duì)照相比下降了0～4.6%，差異不顯著(圖3)。降解試驗(yàn)持續(xù)80天后，綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到18.2～22.4%。經(jīng)菌種A4、A2、B4、D2、C2與D3菌液處理后的闊葉基質(zhì)綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。從整體上看，菌株A4降解綜纖維素的能力最強(qiáng)(80天后與對(duì)照相比下降25.7%)，其次是菌株A2(與對(duì)照相比下降24.4%)，而菌株A3的降解能力最弱(與對(duì)照相比僅下降8.6%)。然而，上文提到菌株B2的纖維素分解指數(shù)為最高(表1)，經(jīng)SNK檢驗(yàn)卻與對(duì)照無(wú)顯著差異。這說(shuō)明纖維素酶活性最強(qiáng)的菌株分解地表可燃物中天然纖維素的能力不一定最強(qiáng)。此外，在降解過(guò)程中，綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)一定波動(dòng)，這表明水溶性化合物的分解導(dǎo)致自身濃度降低，使纖維素相對(duì)濃度有所增加。

圖2 纖維素降解菌的rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

針葉基質(zhì)和針闊混交基質(zhì)的初始綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為37.0%和33.4%。20天后，在8菌株的培養(yǎng)下，2種基質(zhì)綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降到25.9%～29.5%和26.1%～29.0%，與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異(圖3)。在此期間，菌株A3對(duì)針葉可燃物、菌株A2對(duì)針闊混交可燃物中綜纖維素的分解能力最強(qiáng)，菌株D3和B4最弱。80天后，針葉基質(zhì)與混交基質(zhì)綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降到21.8%～26.3%和19.9%～25.6%。除B2外，經(jīng)其他菌種處理后的針葉基質(zhì)綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均與對(duì)照有顯著差異(P<0.05)。A4為對(duì)2種可燃物綜纖維素降解效果最好的菌株(與對(duì)照相比分別下降30.3%和27.1%)。這說(shuō)明在其他菌種對(duì)纖維素的降解率增幅減小時(shí)，A4的降解能力突顯。對(duì)于綜纖維素的降解，擔(dān)子菌為最有效的降解者，因?yàn)樵S多擔(dān)子菌生長(zhǎng)在富含纖維素的枯木或落葉上，利用一組通常由內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶組成的水解酶系降解纖維素(Baldrianetal., 2008)。以上結(jié)果表明，從云杉人工林中篩選出的菌株A4對(duì)3種基質(zhì)的降解效果均較好，適于林地可燃物降解。

圖3 降解試驗(yàn)不同階段不同菌株培養(yǎng)后闊葉、針葉及混交基質(zhì)綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

菌株A4與其他菌株相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的降解綜纖維素的能力。借助掃描電鏡觀察其菌絲附著在葉片表面并侵入葉片組織的生長(zhǎng)情況。降解試驗(yàn)持續(xù)20天后，葉片表面菌絲數(shù)量較少且形態(tài)簡(jiǎn)單(圖4a)，可見(jiàn)由氣生菌絲產(chǎn)生的瓶梗，葉片表面可見(jiàn)經(jīng)其釋放出的分生孢子(圖4d)，形似一串串葡萄狀； 降解持續(xù)80天后，菌絲布滿整個(gè)葉片，形成稠密的網(wǎng)狀(圖4b)，菌絲側(cè)端有指狀分枝沿葉片表面延伸，菌絲體發(fā)達(dá)，較粗，有大量孢子附著(圖4e)； 對(duì)照組葉片表面無(wú)任何菌絲附著(圖4c與4f)。

經(jīng)降解20天后，葉片縱切面未見(jiàn)明顯菌絲和孢子(圖5a與5d)； 降解80天后，在葉片縱切面細(xì)胞組織間，有少量菌絲開(kāi)始侵入及少量孢子附著(圖5e)，與對(duì)照組潔凈的葉片縱切面對(duì)比鮮明(圖5f)。菌株A4是1株高效綜纖維素降解菌，具有侵入葉片組織和降解葉片中綜纖維素的能力。

2.5 地表可燃物野外降解如圖6可知，野外降解持續(xù)6個(gè)月后，經(jīng)小劑量A、B和C菌劑處理后的胡桃楸基質(zhì)綜纖維素降解率均高于對(duì)照，分別達(dá)15.15%、13.96%和17.85%，分別比對(duì)照高11.75%、10.56%和14.45%，無(wú)顯著差異； 經(jīng)中劑量3種不同處理后，綜纖維素降解率分別為19.58%、18.90%和19.97%，比對(duì)照高15.05%、14.37%和15.44%，且差異顯著(P<0.05)； 經(jīng)大劑量A、B和C菌劑降解6個(gè)月后，闊葉基質(zhì)中綜纖維素降解率分別增大到18.91%、19.01%和25.87%，較對(duì)照高15.51%、15.61%和22.47%，其中經(jīng)菌劑C培養(yǎng)后的基質(zhì)綜纖維素降解率達(dá)對(duì)照組的7.6倍，差異顯著(P<0.05)。

至降解試驗(yàn)結(jié)束，經(jīng)小劑量的3種菌劑處理后的落葉松基質(zhì)綜纖維素降解率為12.84%～14.71%，與對(duì)照組差值為7.82%～9.69%，降解程度整體小于胡桃楸基質(zhì)； 中劑量菌劑處理后針葉基質(zhì)綜纖維素降解率為15.78%～18.37%，與對(duì)照組差值為10.76%～13.35%； 大劑量菌劑處理后的針葉基質(zhì)綜纖維素降解率為19.14%～21.68%，比對(duì)照組高14.12%～16.66%，降解效果較闊葉基質(zhì)差。

降解試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，混交可燃物基質(zhì)經(jīng)小劑量3種菌劑處理后綜纖維素降解率從大到小順序?yàn)榫鷦〤、菌劑B、菌劑A，分別比對(duì)照高13.24%、12.37%和11.77%； 混交基質(zhì)經(jīng)中劑量A、B、C菌劑降解6個(gè)月后，其綜纖維素降解率均顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照高15.05%(P<0.05)、14.37%(P<0.05)和15.44%(P<0.05)； 經(jīng)大劑量菌劑處理后，基質(zhì)綜纖維素降解率為菌劑C(22.16%)>菌劑B(20.32%)>菌劑A(19.51%)。

圖4 經(jīng)A4菌液培養(yǎng)后胡桃楸葉片表面菌株生長(zhǎng)電鏡觀察

圖5 經(jīng)A4菌液培養(yǎng)后的胡桃楸葉片縱切面菌株生長(zhǎng)電鏡觀察

圖6 不同菌劑處理后闊葉、針葉及混交基質(zhì)綜纖維素降解率變化

3 討論

纖維素是森林地表可燃物的主要組分，其降解在森林可燃物分解過(guò)程中至關(guān)重要。帽兒山地區(qū)由于地處中溫帶，地表可燃物的分解受到很大程度的制約，其堆積造成森林火災(zāi)隱患。加快森林地表可燃物的分解是降低森林火險(xiǎn)等級(jí)的重要途徑之一(國(guó)家林業(yè)局森林防火辦公室， 2003)。纖維素降解菌能通過(guò)自身酶系統(tǒng)的作用逐步將地表可燃物中復(fù)雜的纖維素大分子分解為簡(jiǎn)單的葡萄糖小分子，從而降解可燃物。本研究篩選出8株高活性纖維素酶菌株，對(duì)可燃物基質(zhì)均發(fā)生不同程度的降解，但降解能力強(qiáng)弱與纖維素分解指數(shù)大小并不順序相符，分解指數(shù)最大的菌種的降解能力并非最強(qiáng)。推測(cè)不同菌株達(dá)到最大酶活力所需的時(shí)間不同，菌株在CMC-Na培養(yǎng)基上產(chǎn)生的水解圈大小與其產(chǎn)生的纖維素降解酶活力之間的相關(guān)性不是很強(qiáng)，說(shuō)明采用此方法只能為定性判斷菌株是否具有降解纖維素的能力提供參考。本研究中，A4為降解地表可燃物中纖維素能力最強(qiáng)的菌株，但是單一菌株無(wú)法產(chǎn)生完整的纖維素降解酶系。若提高纖維素降解效果，還需多種酶之間的協(xié)同作用。另外，由于室內(nèi)降解試驗(yàn)條件的可控性強(qiáng)，所得結(jié)果有一定局限性，野外環(huán)境影響因素較多，由室內(nèi)試驗(yàn)篩選出的菌株是否在野外仍有較強(qiáng)降解能力，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本研究在室內(nèi)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了野外降解試驗(yàn)，選用由室內(nèi)試驗(yàn)篩選出的高效降解菌制成單一菌劑，同時(shí)用2株纖維素降解菌構(gòu)建成混合菌劑，分別對(duì)地表可燃物樣品進(jìn)行噴灑。結(jié)果表明，單一菌劑與混合菌劑均對(duì)野外地表可燃物有降解效果，且后者降解效果優(yōu)于前者，充分體現(xiàn)了2株菌在綜纖維素降解過(guò)程中的協(xié)同作用。后續(xù)研究可混合培養(yǎng)多個(gè)纖維素降解菌株，摸索其最佳產(chǎn)酶條件，構(gòu)建纖維素降解復(fù)合菌系，還可加入對(duì)纖維素降解菌不具拮抗作用的木質(zhì)素降解菌，協(xié)同降解森林地表可燃物。

4 結(jié)論

本研究共分離出15株真菌并從中篩選出了8株高活性纖維素酶菌株。室內(nèi)降解試驗(yàn)表明，菌株A4(緊密帚枝霉)為本研究篩選出的纖維素高效降解真菌，菌株A2(肉色隔孢伏革菌)次之。野外降解試驗(yàn)表明，施加菌劑的3種基質(zhì)綜纖維素降解效果均優(yōu)于對(duì)照組，對(duì)于施加同種劑型的可燃物，不同劑量使可燃物基質(zhì)綜纖維素降解率排序?yàn)榇髣┝?中劑量>小劑量>對(duì)照； 3種可燃物基質(zhì)綜纖維素呈現(xiàn)出相同的降解規(guī)律，綜纖維素降解率表現(xiàn)為菌劑C(A4+A2) >菌劑B(A4)>菌劑A(A2)>對(duì)照，即混合菌劑降解效果優(yōu)于由菌株A4及A2制得的單一菌劑。綜上所述，菌株A4在自然條件下對(duì)地表可燃物中綜纖維素也表現(xiàn)出較強(qiáng)降解能力，且與其他纖維素降解菌種構(gòu)建的混合菌劑對(duì)可燃物中綜纖維素降解效果更佳，可在后續(xù)試驗(yàn)中探討最佳產(chǎn)酶條件，進(jìn)一步提高復(fù)合菌系的降解能力。