裴曉亞 Maduka Nilakshi Jayasekara Arachchige 朱晨慧 王 敦

(西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲學(xué)研究所 楊凌 712100)

川西高原是四川省西部與青海、西藏交界的高海拔區(qū)，地勢跌宕起伏,氣候復(fù)雜多變,地域差異顯著，孕育著豐富的生物種類，其中昆蟲和真菌資源十分豐富。全球昆蟲病原真菌種類豐富，迄今已記錄800多種蟲生真菌，我國已發(fā)現(xiàn)400余種(蒲蟄龍等，1996)。昆蟲病原真菌是重要的生物防治資源，同時(shí)也可以穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)中昆蟲種群。利用昆蟲病原真菌防治害蟲，對(duì)人、動(dòng)物無毒害作用，對(duì)環(huán)境友好，因此在植物保護(hù)研究中受到廣泛關(guān)注(王濱等， 2005； 劉春來， 2017； 李增智， 2015)。目前，物種多樣性海拔分布格局及其形成機(jī)制是多樣性研究的一個(gè)重要課題(徐翔等，2018)，蟲生真菌的分布格局與海拔區(qū)域也有密切關(guān)系(李亦菲等， 2018)。

本文利用Hiseq技術(shù)對(duì)川西高原13個(gè)海拔樣地的土壤樣品進(jìn)行測序，探討川西高原的昆蟲病原真菌種類資源、分布以及蟲生真菌多樣性沿海拔梯度的變化規(guī)律，分析海拔變化對(duì)昆蟲病原真菌多樣性的影響，為昆蟲病原真菌的開發(fā)利用以及川西高原物種多樣性的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

按照“S”形取樣法，在雅安(多營鎮(zhèn)、天全縣、二郎山)、甘孜(雅江、新龍、滬定)和康定(折多山、新都橋)8個(gè)地域內(nèi)共13個(gè)不同海拔區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)取樣。為避免土壤空間分布不均所導(dǎo)致的誤差，在每個(gè)海拔分別選取5個(gè)取樣點(diǎn)，每2個(gè)樣點(diǎn)之間間隔大于50 km。土壤樣品采集后立即封口，-10 ℃凍存于車載冰箱中，并用GPS記錄坐標(biāo)、貼標(biāo)簽。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將每個(gè)海拔的5個(gè)樣品混合，倒在滅菌后的紙上，用鑷子去除樣品中的植物根系、昆蟲、石塊等雜物，放于無菌臺(tái)內(nèi)風(fēng)干、研磨，過1～2 mm篩后隨機(jī)分為3份，保存于-80 ℃冰箱中，作為土壤微生物 DNA 提取的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。各土壤樣品信息如表1所示。

表1 土壤樣品信息

1.2 試驗(yàn)方法

土壤總DNA的提取參考并改進(jìn)Bürgmann等(2001)的方法，經(jīng)過物理研磨、化學(xué)試劑萃取獲得總DNA。土壤總DNA的純化參考購自BioFlux公司DNA純化試劑盒(Gel DNA Purification Kit)的操作說明進(jìn)行。

分別用13個(gè)土壤樣品的DNA為模板，擴(kuò)增引物參考White(1990)方法，分別為ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’),ITS4(5’TCCTCC GCTTATTGATATGC3’)，擴(kuò)增體系為25 μL(10×Buffer 2.5 μL、d NTP 2 μL、上下引物各1 μL、模板0.3 μL、dd H2O 18.7 μL)，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳處理、膠回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行回收，使用illumina Hiseq進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過拼接、過濾、去除嵌合體成為有效數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行后續(xù)生物信息分析： 采用OTU(operational taxonomic units)即操作分類單元[為了便于進(jìn)行分析，給某一個(gè)操作分類單元(品系、種、屬、分組等)設(shè)置同一標(biāo)志，即97%的相似度進(jìn)行OTU聚類], 結(jié)合微生物目前最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫——Unite數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋和物種分類分析。 基于OTU的分析，獲得樣品的豐度信息，挖掘樣品之間的群落結(jié)構(gòu)和物種組成差異。

采用香儂指數(shù)(Shannon)Hshannon、辛普森指數(shù)(Simpson)D、Chao1指數(shù)(OTU估計(jì)數(shù)SChao1及覆蓋率Coverage進(jìn)行生物多樣性分析。計(jì)算公式如下：

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/[2(n2+1)]，

coverage=[1-(ni/N)]×100%。

式中，Sobs為OTU實(shí)測數(shù)；ni為含有i條序列的OTU數(shù)目，N為全部序列數(shù)；Pi為ni/N。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理及OTU數(shù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)13個(gè)海拔樣品的測序結(jié)果表明，平均每個(gè)樣品得到85 009條有效序列； 堿基質(zhì)量值Q30比例均大于84.34%，滿足后期分析的要求。按照序列的相似性高于97%定義為一個(gè)OTU，共獲得51 515個(gè)OTU，其中13個(gè)樣品共有的OTU個(gè)數(shù)為50個(gè)，樣品DY、TQ、LD、ER、ZDS、Y1、Y2、Y3、XD、Y4、XL、Y5、Y6特有的OTU個(gè)數(shù)分別為228、1 179、863、682、1 346、1 466、1 556、316、1 540、724、790、1 880、1 127。

2.2 土壤中真菌的α多樣性分析

13個(gè)土壤樣品中真菌的α多樣性如表2所示。所有樣品的Coverage均超過94%，說明測序深度合理，可以反應(yīng)樣本的真實(shí)情況，其中，香儂指數(shù)在5.14～9.27之間， 辛普森指數(shù)在0.77～0.99之間， Chao1指數(shù)在2 172～5 608之間。

表2 土壤中真菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 土壤中真菌等生物種類

對(duì)13個(gè)樣品51 515個(gè)OTU的分析表明，在門水平上，相對(duì)豐度排名前十位的分別為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Bassidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、纖毛門(Ciliophora)、壺菌門(Chytridiomycota)、綠藻門(Chlorophyta)、羅茲菌門(Rozellomycota)、絲足蟲類(Cercozoa)、球囊菌門(Glomeromycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota)(圖1)。其中，子囊菌門與擔(dān)子菌門在每個(gè)樣品中的共同占比超過69%，占絕對(duì)優(yōu)勢。除樣品Dy之外，剩余12個(gè)樣本的優(yōu)勢門均為子囊菌門，占比均超過49%，次優(yōu)勢門為擔(dān)子菌門，占比均超過6%。在樣品Dy中，優(yōu)勢菌門為擔(dān)子菌門，占比為62%，次優(yōu)勢菌門為子囊菌門，占比13.7%。排名前十位的門，除羅茲菌門與芽枝霉門外，有8個(gè)門在13個(gè)樣品中均有分布。

圖1 土壤真菌在門水平的分布

從屬水平的分布來看(圖2)，13個(gè)樣品間的差異比較顯著，相對(duì)豐度排名前十位的分別是Echinoderma、絲膜菌屬(Cortinarius)、青霉屬(Penicillium)、被孢霉屬(Mortierella)、棒束孢屬(Isaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、赤霉菌屬(Gibberella)隱球菌屬(Cryptococcus)、小菇屬(Mycena)。13個(gè)樣本中最優(yōu)勢屬均有差異，在樣品DY中，Echinoderma的占比為47.6%，占絕對(duì)優(yōu)勢； 樣品Y3中的最優(yōu)勢屬為絲膜菌屬，占比24%； 其他樣本中各最優(yōu)勢屬均有差異。除Echinoderma、棒束孢屬與假裸囊菌屬之外，其他7個(gè)屬在13個(gè)樣本中均有分布。

圖2 土壤真菌在屬水平的分布

2.4 土壤中昆蟲病原真菌的種類

13個(gè)不同海拔樣本中的昆蟲病原真菌主要分布于子囊菌門肉座菌目(Hypocreales)的麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草科(Cordycipitaceae)和線蟲草科(Ophiocordycipitaceae)。這3個(gè)科的OTU約占總OTU的2.08%，而每個(gè)科的占比在各個(gè)采樣點(diǎn)差距很大(圖3)。對(duì)于麥角菌科，樣品ZDS和DY的OTU占肉座菌目的6%，在13個(gè)樣品中最高； Y4在13個(gè)樣品中最低，只有0.08%； 13個(gè)樣品平均占肉座菌目OTU的3%。對(duì)于蟲草科，Y4的OTU在肉座菌目中的占比在13個(gè)樣品最高，為 78%； 在XD中只占0.5%； 平均占肉座菌目的21%。 對(duì)于線蟲草科，13個(gè)樣品的OTU在這個(gè)科中的占比是3個(gè)科中最低的，平均值只有1%，其中Y3占比最低，只有0.05%； Dy和Y6最高。

在13個(gè)樣品中檢測到的昆蟲病原真菌分屬于子囊菌門肉座菌目3個(gè)科中的18個(gè)屬。其中：麥角菌科7個(gè)屬，蟲草科6個(gè)屬，線蟲草科5個(gè)屬；綠僵菌屬(Metarhizium)、普可尼亞屬(Pochonia)以及彎頸霉屬(Tolypocladium)在全部樣品中都被檢測到； 棒束孢屬、蟲草屬(Cordyceps)以及線蟲草屬(Ophiocordyceps)在12個(gè)樣品中被檢測到； 淡紫紫霉屬(Purpureocillum)在9個(gè)樣本中被檢測到； 余下11個(gè)屬都分別只在1～4個(gè)樣本中被檢測到。如表3所示，13個(gè)樣品在屬水平上差異很大，Y1中屬的種類最多，共有11個(gè)，DY中屬的種類最少，只有4個(gè)，分別為綠僵菌屬、普可尼亞屬、Rotiferophthora、彎頸霉屬。

在麥角菌科中，綠僵菌屬在13個(gè)樣品中全都被檢測到，除樣品Y5之外，在余下樣本中的占比均超過60%，占絕對(duì)優(yōu)勢； 在蟲草科中，除樣品DY之外，棒束孢屬和蟲草屬在余下的12個(gè)樣品中全部被檢測到，且共同占比均超過68%，占絕對(duì)優(yōu)勢，但不同的樣本中，最優(yōu)勢屬存在差異； 線蟲草科中彎頸霉屬在全部13個(gè)樣本中都被檢測到，在樣品DY、TQ、ER、ZDS、XD、Y5中都為優(yōu)勢屬，淡紫紫霉屬在9個(gè)樣品中均為檢測出，且在樣品LD、Y1、Y4、Y5中均為優(yōu)勢屬，在樣品Y3中，彎頸霉屬與線蟲草屬的占比均為50%，同為優(yōu)勢屬。

圖3 不同樣品OTU數(shù)量占肉座菌目OTU數(shù)量百分比

表3 蟲生真菌各屬OTUs占同一樣品本科所有OTUs的比例

2.5 蟲生真菌多樣性沿海拔梯度的變化

13個(gè)樣品的采樣地點(diǎn)均在川西高原，DY、TQ、LD、ER、ZDS、Y1、Y2、Y3、XD、Y4、XL、Y5、Y6海拔依次升高(500～4 300 m)，跨度達(dá)3 800 m。通過OTU分析子囊菌門肉座菌目3個(gè)科中的優(yōu)勢屬的OTU占比(圖4)發(fā)現(xiàn)：麥角菌科的普可尼亞屬隨海拔的升高沒有明顯變化，綠僵菌屬在500～1 000 m隨海拔升高而降低，在2 100 m處達(dá)到峰值，然后隨海拔的升高而下降； 在蟲草科中，棒束孢屬和蟲草屬隨海拔高度的變化存在差異，但是這種變化并不是呈梯度遞增或是遞減，在500～2 100 m的范圍內(nèi)變化不大，基本在1%左右浮動(dòng)，2 800 m之后數(shù)值開始大幅度變化，2 800～3 400 m依次遞增，2個(gè)屬分別在3 100 m與3 400 m處達(dá)到第1個(gè)頂峰，之后在3 471 m處達(dá)到一個(gè)低值，在3 700 m處又突然增高到達(dá)第2個(gè)頂峰，也是棒束孢屬的最高值，3 700 m后逐漸減少，而蟲草屬在4 300 m處達(dá)到第3個(gè)峰值，且為最高值。由此推斷，海拔會(huì)影響蟲生真菌的多樣性，特別是蟲草科，其優(yōu)勢屬OTU在肉座菌目OTU的占比與海拔相關(guān)，在4 300 m采樣點(diǎn)蟲草屬占比最大，在3 700 m采樣點(diǎn)棒束孢屬的占比最大，而在2 100 m以下蟲草科真菌種類極少。海拔3 471 m處蟲草科的2個(gè)優(yōu)勢屬均處于2個(gè)峰值(3 400、3 700 m)占比之間，其比值很低，可能與其他環(huán)境因子有關(guān)，也可能是測序樣本誤差導(dǎo)致，具體原因還需進(jìn)一步研究。線蟲草科的優(yōu)勢屬彎頸屬與淡紫紫霉屬隨海拔的變化其變化差異不大，基本在1%以下。

圖4 真菌優(yōu)勢屬與海拔的相關(guān)性

3 討論

豐富的物種資源對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)平衡起著至關(guān)重要的作用，土壤功能的保持同樣需要多種微生物資源來平衡(雷霆等， 2007)。本文通過對(duì)川西高原的土壤樣品進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)昆蟲病原真菌共有18個(gè)屬，表明川西高原昆蟲病原真菌群落豐富，其昆蟲病原真菌類型數(shù)量高于安徽紫蓬山國家森林公園(劉玉軍等， 2018)，安徽瑯琊山、鷂落坪、麻姑山(陳名君， 2008)和山西龐泉溝自然保護(hù)區(qū)(李文英等， 2003a)等等。

昆蟲病原真菌存在明顯地域分布特點(diǎn)，其種類豐富程度與環(huán)境有很大的關(guān)系(李文英等， 2003b)，包括海拔、植被以及地理位置等都與昆蟲病原真菌的種類數(shù)量與組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異(陳名君， 2008)。本文的分析結(jié)果表明，13個(gè)樣本的昆蟲病原真菌種類及分布都存在差異，檢測到的蟲生真菌主要存在于肉座菌目的3個(gè)科中，其中各科的優(yōu)勢屬的分布均有差異，棒束孢屬和蟲草屬作為蟲草科的優(yōu)勢屬，在除樣本DY以外都有分布，且在海拔超過2 100 m時(shí)相對(duì)豐度升高，表明其適合在高海拔地區(qū)生長； 白僵菌作為1種重要的蟲生真菌，在此次取樣點(diǎn)中鮮有分布，而在其他地區(qū)昆蟲病原真菌的調(diào)查中常常為優(yōu)勢屬種(周家喜等， 2017； 王四寶等， 2004)，但這些地區(qū)的海拔均低于2 000 m，而川西高原海拔遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2 000 m。綠僵菌屬的相對(duì)豐度雖在2 100 m處有峰值，但總體表現(xiàn)為隨海拔的升高而下降，與Masoudi等(2018)的研究結(jié)果一致； 蟲草科在2 100 m以上地區(qū)相對(duì)豐度較大，適合在高海拔地區(qū)生長，可能是因?yàn)闅夂驐l件適合且高海拔地區(qū)人為因素的影響相對(duì)較小，具體原因有待進(jìn)一步研究。

對(duì)川西高原的昆蟲病原真菌多樣性的研究有助于昆蟲病原真菌的開發(fā)與利用，也可為川西高原物種多樣性的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)川西高原的13個(gè)不同地點(diǎn)的土壤真菌樣品進(jìn)行測序，分析其病原微生物的種類及分布。門水平上，子囊菌門與擔(dān)子菌門在每個(gè)樣品中的共同占比超過69%，占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢。從屬水平分布來看，不同樣品的優(yōu)勢屬存在差異，說明13個(gè)樣品的蟲生真菌種類存在差異。昆蟲病原真菌主要分布于子囊菌門肉座菌目的3個(gè)科。蟲草屬與棒束孢屬的相對(duì)豐度隨海拔的升高，分別在4 300與3 700 m達(dá)到峰值； 而綠僵菌屬隨海拔的升高其相對(duì)豐度降低，說明相對(duì)于蟲草菌科真菌，低海拔地區(qū)綠僵菌屬真菌豐富度較高。