金 鑫 周鈺林 陳錫強 張立濤 葛 順△

(1濟寧醫(yī)學院生物科學學院，日照 276826；2山東省科學院生物研究所，濟南 250014)

據(jù)《本草綱目》記載，硼砂具有清涼解毒、消積塊和除痰熱等功效，是我國的一味傳統(tǒng)中藥。硼砂對乳腺癌、食管癌、宮頸癌和陰道癌等具有一定的療效[1]。但是硼砂對人體具有一定的損傷，進入人體后會與胃酸反應生成硼酸不易排出[2]，易蓄積中毒，表現(xiàn)為頭痛、頭暈，嚴重可致死亡[3]。目前，硼砂對大鼠、果蠅、鯽魚的毒性研究已見報道[4-6]，但是未有其發(fā)育毒性方面的研究。

斑馬魚和人類有87%的基因同源性，且在生理功能、發(fā)育過程、器官構造等方面與哺乳動物非常接近[7]，同時斑馬魚具有胚胎透明易于觀察、給藥劑量少和體外受精等特點[8-9]，是理想的模式生物，而且因為減少、替代和優(yōu)化等動物實驗原則，實現(xiàn)保護動物福利和減少哺乳動物等較高級實驗動物的使用量，斑馬魚發(fā)育毒性實驗替代哺乳動物模型已廣泛應用于藥物的發(fā)育毒性與致畸性研究[10-11]。本研究以斑馬魚為研究對象，探討硼砂對斑馬魚的發(fā)育毒性，為硼砂的毒理機制提供科學實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

野生型AB品系斑馬魚18條(4月齡)和肝臟轉基因T3(lfabp:EGFP)品系斑馬魚18條(4月齡)，由山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供。

1.2 試劑與儀器

硼砂(中國食品藥品檢定研究院，批號：190166-201601)，錫紙遮光室溫保存，用斑馬魚養(yǎng)殖水溶解稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用；三卡因(Sigma公司)，用蒸餾水配制成質量分數(shù)為0.16%的溶液，放4℃冰箱保存；斑馬魚養(yǎng)殖水，19.26μg/ml MgSO4、12.67μg/ml KCl、44.4μg/ml CaCl2和292.22μg/ml NaCl[12]。

斑馬魚飼養(yǎng)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)；光照培養(yǎng)箱HPG280BX(哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司)；體視熒光顯微鏡SZX16(Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1魚卵收集 挑選健康性成熟的野生型AB品系和肝臟轉基因T3(lfabp:EGFP)品系斑馬魚按雌雄比例1∶2放入交配缸中，用隔板隔開，16h后抽隔板，2h后即可收集魚卵，移入盛養(yǎng)殖水的魚缸中，滴亞甲基藍溶液，將魚缸放光照培養(yǎng)箱(溫度：28℃；光周期：14h光照，10h黑暗)培養(yǎng)。

1.3.2發(fā)育毒性實驗 將受精6h的野生型AB品系斑馬魚胚胎在顯微鏡下觀察，將發(fā)育正常的胚胎隨機轉入12孔板中，每孔20個胚胎，3ml不同硼砂濃度的養(yǎng)殖水，每個濃度3個重復孔。硼砂濃度梯度設為0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.9mg/ml，不加硼砂的設為空白對照。每日對斑馬魚胚胎或幼魚進行觀察并記錄數(shù)據(jù)，將死亡的胚胎或幼魚即時清除，以受精后小時(hpf)為時間段，在受精48h更換新的硼砂濃度的養(yǎng)殖水。每天對斑馬魚的自主活動次數(shù)、心率、孵化數(shù)、畸形數(shù)和死亡數(shù)進行記錄。利用肝臟熒光且發(fā)育正常的肝臟轉基因T3(lfabp:EGFP)品系斑馬魚幼魚研究硼砂對肝臟發(fā)育的影響，在顯微鏡下挑選發(fā)育72h的健康幼魚，將其隨機轉入12孔板中，每孔20個胚胎，3ml不同硼砂濃度的養(yǎng)殖水，每個濃度3個重復孔。硼砂濃度梯度為0.1mg/ml、0.3mg/ml和0.5mg/ml，不加硼砂的設為空白對照。每天將死亡的幼魚即時清除并在給藥后48h更換新的不同硼砂濃度的養(yǎng)殖水。每天用三卡因溶液將斑馬魚幼魚麻醉，在體視熒光顯微鏡下對斑馬魚幼魚進行拍照并觀察綠色熒光肝臟面積大小。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 硼砂對斑馬魚胚胎自主活動的影響

斑馬魚胚胎24hpf，隨著硼砂濃度的升高斑馬魚胚胎自主活動次數(shù)逐漸降低，其中0.9mg/ml硼砂處理組[(1.72±1.99)次/min]斑馬魚胚胎自主活動次數(shù)不足空白對照組[(3.94±2.21)次/min]的50%，具有顯著性差異(P<0.01)。見圖1。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

2.2 硼砂對斑馬魚胚胎孵化率的影響

空白對照組48hpf的孵化率為(98.33±2.89)%，硼砂處理組(0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.9mg/ml)的胚胎已全部孵化，無統(tǒng)計學差異?？瞻讓φ战M和硼砂處理組72hpf的斑馬魚胚胎均全部孵化。見圖2。

圖2 硼砂對斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.3 硼砂對斑馬魚幼魚心率影響

硼砂各處理組和空白對照組受精48h后的斑馬魚胚胎在心率上無統(tǒng)計學差異；72、96hpf隨著硼砂濃度的逐漸升高，斑馬魚幼魚的心率逐漸降低，硼砂各處理組顯著低于空白對照組(P<0.01)。見圖3。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

2.4 硼砂對斑馬魚幼魚畸形率的影響

隨著硼砂濃度的升高，96hpf后的斑馬魚胚胎畸形率逐漸上升(圖4)，0.3、0.6mg/ml硼砂處理組與空白對照組在斑馬魚胚胎畸形率上無統(tǒng)計學差異，0.9mg/ml硼砂組斑馬魚幼魚的畸形率達到了70%(P<0.01)。斑馬魚幼魚的畸形主要表現(xiàn)為卵黃囊水腫、心包水腫和脊柱彎曲等癥狀(圖5)。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

注：YSE.卵黃囊水腫；PE.心包水腫；SC.脊柱彎曲。

2.5 硼砂對斑馬魚死亡率的影響

硼砂各處理組和空白對照組的斑馬魚胚胎在24、48、72hpf死亡率無統(tǒng)計學差異。0.9mg/ml硼砂組斑馬魚胚胎96hpf死亡率顯著性升高(P<0.01)，達到了50%以上；120hpf死亡率幾乎達到了100%(P<0.01)。見圖6。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

2.6 硼砂對斑馬魚肝臟發(fā)育的影響

斑馬魚胚胎96hpf，硼砂各處理組和空白對照組肝臟大小無統(tǒng)計學差異，120、144hpf，0.5mg/ml硼砂組斑馬魚肝臟明顯小于空白對照組(P<0.01)。見圖7，8。

圖7 斑馬魚幼魚肝臟熒光信號圖

注：與空白對照組相比，*P<0.01

3 討論

硼砂又叫月石，為硼酸鹽類硼砂族礦物，其功效為清熱消痰、解毒防腐，常用于治療咽喉腫痛、口舌生瘡、目赤翳障胬肉等。在脊椎動物發(fā)育過程中，硼發(fā)揮著重要的作用，硼的缺乏會導致妊娠起始和胚胎發(fā)育有關的基因下調，導致胚胎發(fā)育早期不良。但是高濃度的硼會干擾雞和大鼠某些器官的發(fā)育[13]。在利用斑馬魚模型對硼砂發(fā)育毒性進行研究中，斑馬魚胚胎自主活動次數(shù)、孵化率、心率、畸形率、畸形形態(tài)和死亡率等是重要的評價指標[14]。高劑量硼可降低雞胸肌肉纖維中葡萄糖、糖原、乳酸和ATP的濃度，破壞肌纖維中線粒體結構，影響其能量代謝[15]。本文結果顯示，斑馬魚的自主活動次數(shù)隨硼砂濃度的升高逐漸降低，硼砂可降低斑馬魚的自主活動次數(shù)和心率，增加死亡率和畸形率(心包水腫，卵黃囊水腫和脊柱彎曲)，高濃度的硼砂在受精120h死亡率達到了98.3%，在受精120h和144h后，0.5mg/ml硼砂處理組斑馬魚肝臟明顯小于空白對照組，提示高濃度的硼砂可能破壞斑馬魚體內的能量代謝，這與雞中的研究結果一致。此外，高劑量的硼可能引起細胞渾濁腫脹[16]，而斑馬魚的畸形是以卵黃囊水腫和心包水腫為主。硼誘發(fā)Gcn2激酶催化eIF2α的磷酸化，干擾翻譯的起始，導致蛋白質合成的抑制作用[17]。因此，斑馬魚心臟和肝臟等器官的發(fā)育受到了抑制。

綜上所述，高濃度的硼砂在斑馬魚發(fā)育過程中會減少其自主活動次數(shù)，增加其畸形率和死亡率，同時抑制心臟和肝臟的發(fā)育，具有發(fā)育毒性，但是當硼砂濃度低于0.3 mg/ml時對斑馬魚發(fā)育幾乎沒有影響，可以作為其安全濃度。在未來，需要進一步對硼砂毒性作用靶點進行分析，確定其毒性機理，為其進一步的應用奠定理論基礎。