李富琴，石永新，宋 暉

[中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明),廣東 深圳 518106]

骨缺損的修復(fù)是臨床上常見的治療難題，由于受自體骨移植諸多并發(fā)癥的限制，目前越來(lái)越多的學(xué)者將研究重點(diǎn)放在了骨支架材料的研發(fā)上[1]。良好的骨支架材料需要滿足良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性，無(wú)致畸致癌，具有一定要求的機(jī)械性能及無(wú)不良反應(yīng)等，其中最重要的特征是具有良好的生物相容性[2]。聚磷酸鈣(calcium polyphosphate，CPP)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型材料，具有良好的骨誘導(dǎo)性，優(yōu)良的可控降解性及體內(nèi)生物相容性等諸多優(yōu)點(diǎn)[3]，成為骨修復(fù)材料的理想材料。淫羊藿苷(ICA)是目前常用的成骨誘導(dǎo)劑，近年來(lái)的研究成果肯定了ICA能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,可用于骨組織工程中促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[4]。二者結(jié)合制成復(fù)合骨支架后，其生物相容性如何，尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1材料制備

1.1.1復(fù)合骨支架的制備：本次研究經(jīng)過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。CPP(聚磷酸鈣,批號(hào)CAS10031-30-8,南京化學(xué)試劑股份有限公司)和ICA(淫羊藿苷, 批號(hào)YYH-120318,西安昊軒生物有限公司)。將Ca(H2PO4)2·H2O在500℃保溫后再升溫至熔融，淬冷后制得CPP非晶燒料，用無(wú)水乙醇清洗，烘箱烘干，研磨過(guò)篩,選取粒徑范圍為70～100 μm的CPP 非晶粉末用于實(shí)驗(yàn)燒料。將上述制得的CPP燒料放入電阻爐中二次燒結(jié),再緩慢升溫至580℃后保溫一段時(shí)間, 然后冷卻得到CPP 骨支架材料,按4∶1質(zhì)量比例加入淫羊藿苷;選用25%檸檬酸+68%水+5%檸檬酸鈉作為固化液；固液比例為3∶1，調(diào)制成糊，倒進(jìn)直徑10 mm、厚2 mm的自制模型，自然干燥后，脫模，得到所需CPP-ICA復(fù)合骨支架模塊。將該復(fù)合骨支架用蒸餾水振蕩并清洗10 min，高溫高壓(121℃，20 min)的條件下滅菌、烘干、備用。

復(fù)合骨支架大體觀察外觀白色，表面不光滑，整體呈均勻細(xì)小的蜂窩狀空隙結(jié)構(gòu)。電鏡下見支架呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)均勻的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，有支架小梁連接空隙結(jié)構(gòu)，微孔結(jié)構(gòu)成類圓形，孔徑大小相對(duì)較均勻。支架的孔徑約為110～160 μm，孔隙率為(71.69±0.86)%，孔隙密度為(0.24±0.07)g/cm3。支架具有良好的親水性，吸水后復(fù)合骨支架均勻膨大，體積增加。經(jīng)力學(xué)測(cè)試，CPP/ICA 復(fù)合骨支架具有良好的力學(xué)性能,可以滿足實(shí)驗(yàn)用大白兔體內(nèi)大段骨缺損移植的生物力學(xué)要求[5]。

1.1.2復(fù)合骨支架浸提液的制備:取備用的復(fù)合骨支架材料，浸提介質(zhì)為含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，按1 g∶10 ml比例，5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中浸提24 h,離心后取上清液,過(guò)濾并除菌,保存在100 ml瓶中,在4℃保存，并在24 h內(nèi)使用。

1.2方法

1.2.1成骨細(xì)胞MG63與CPP-ICA復(fù)合骨支架共同培養(yǎng):取備用的復(fù)合骨支架，PBS反復(fù)沖洗3次，在DMEM培養(yǎng)液中浸泡1 d，置入24孔板，每孔1塊，取MG63細(xì)胞懸液20 μl，濃度為1×106個(gè)/ml，接種在復(fù)合骨支架模塊表面，每種模塊設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下孵育，4 h后，加入DMEM培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)孵育后每24小時(shí)更換培養(yǎng)液，不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，拍照記錄。

1.2.2成骨細(xì)胞與CPP-ICA復(fù)合骨支架浸提液共同培養(yǎng):以5×104細(xì)胞/ml的濃度制備細(xì)胞懸浮液，接種在一個(gè)有效孔96的孔板上，每孔100 μl，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h。定義實(shí)驗(yàn)組(骨骼材料骨提取物)、陽(yáng)性對(duì)照組(6.4 g/L苯酚溶液)、陰性對(duì)照組(10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，各組6個(gè)復(fù)孔，吸出原培養(yǎng)液，每孔加入100 μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24小時(shí)更換一次細(xì)胞懸浮液。觀察和拍攝每組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長(zhǎng)情況。CPP-ICA復(fù)合骨支架毒性的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)如下：①無(wú)細(xì)胞毒性：細(xì)胞貼壁附著好，形態(tài)為三角形或梭形，無(wú)異常形態(tài)；②輕度細(xì)胞毒性作用：細(xì)胞貼壁黏附好，部分細(xì)胞濃縮，少于1/3，偶爾有懸浮細(xì)胞；③中度細(xì)胞毒性作用：細(xì)胞貼壁黏附較差，細(xì)胞固縮超過(guò)1/3，有細(xì)胞懸?。虎苤囟燃?xì)胞毒性作用：細(xì)胞不貼壁及生長(zhǎng)，超過(guò)90%的細(xì)胞已懸浮死亡。

1.2.3細(xì)胞活性檢測(cè):用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。取5×104細(xì)胞/ ml的細(xì)胞懸液,接種于3塊96有效孔板，每有效孔接種100 μl，在5%CO2培養(yǎng)箱37℃條件培養(yǎng)24 h后，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并且抽吸培養(yǎng)物的原溶液，每孔100 μl。余孔繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在24 h、48 h、72 h更換懸液1次。在24 h、48 h和72 h后取出處理后的其中一塊培養(yǎng)板，將MTT 20 μl添加到每個(gè)孔中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸出原始培養(yǎng)溶液，加入100 μl DMSO，將溶液振蕩10 min。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量吸光度A值，取平均值。 計(jì)算細(xì)胞增殖率RGR(%)，RGR=CPP-ICA復(fù)合骨支架浸提液A均值/陰性對(duì)照組A均值×100%。通過(guò)細(xì)胞毒性分類方法進(jìn)行標(biāo)記[2]，見表1。

表1 細(xì)胞毒性分類方法標(biāo)記表

2 結(jié)果

2.1MG63與CPP-ICA復(fù)合骨支架共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:共培養(yǎng)第4天后，觀察MG63細(xì)胞和CPP-ICA復(fù)合骨支架接觸生長(zhǎng)情況，見邊緣均接良好，MG63細(xì)胞緊緊貼附復(fù)合骨支架邊緣生長(zhǎng)，細(xì)胞多呈梭形，形態(tài)正常。

2.2MG63細(xì)胞與CPP-ICA復(fù)合骨支架浸提液共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:在繼續(xù)培養(yǎng)的第24小時(shí),第48小時(shí),第72小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好,生長(zhǎng)快，狀態(tài)良好，數(shù)量逐步增加，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、三角形及多邊形，其中以長(zhǎng)梭形細(xì)胞居多，與陰性對(duì)照組細(xì)胞情況基本相似，而陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)異常，數(shù)量顯著減少，細(xì)胞固縮，部分細(xì)胞逐漸崩解。見圖1。

圖1 圖a、b、c分別為培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變圖，如圖可見細(xì)胞體積增大，胞漿豐富，數(shù)量迅速增長(zhǎng)，形態(tài)呈梭形和多邊形，細(xì)胞突起較前增多，細(xì)胞聚集成簇或融合成片

2.3各組MG63細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況比較:各組MG63細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖情況見表2及表3。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)各組細(xì)胞光吸收值(A值)比較

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組的RGR值及細(xì)胞毒性等級(jí)

由表2可見，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的A值無(wú)明顯差異(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組A值逐漸降低，培養(yǎng)24 h，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A值高于陽(yáng)性對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在培養(yǎng)48 h及72 h時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組A值均明顯低于實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。由表3可見，在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組RGR值高于100%，細(xì)胞毒性等級(jí)為0級(jí)。

3 討論

骨缺損是臨床上常見的疾病，由于受自體供骨量有限及供骨區(qū)并發(fā)癥等所限[6]，骨修復(fù)材料成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。骨組織支架工程目前被認(rèn)為是治療骨缺損這一世界性難題的首選方法[7]。骨支架需要滿足良好的骨誘導(dǎo)性及傳導(dǎo)性、生物相容性及足夠的力學(xué)性能、可提供成骨細(xì)胞或直接成骨、形成良好的材料-骨組織界面等[8]。其中良好生物相容性是生物材料最基本的要求，細(xì)胞毒性為3～5級(jí)的材料為生物相容性不合格[2]。由于單一的骨修復(fù)材料很難同時(shí)滿足以上要求，復(fù)合骨支架成為今年來(lái)研究的熱點(diǎn)[9]。有學(xué)者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞等種子細(xì)胞與骨支架復(fù)合，經(jīng)骨誘導(dǎo)后分化為成骨細(xì)胞，以增強(qiáng)骨支架的成骨性[10]。

本研究選用CPP作為骨支架，CPP是一種新型的可降解的骨修復(fù)材料[11]，CPP具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)，在動(dòng)物體內(nèi)10 d便可逐漸降解分化，誘導(dǎo)骨質(zhì)形成,且主鏈依靠大量P-O鍵的連接，類似于ATP中高能磷酸鍵[12]。P-O鍵降解斷鏈可釋放出能量供細(xì)胞活動(dòng)，降解產(chǎn)物的成分為游離的鈣離子、磷離子及可溶性磷酸鹽、鈣鹽，無(wú)局部炎性反應(yīng)。在組織工程研究常作為骨支架材料使用，在骨組織的缺損修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用前景[13]。ICA能夠促進(jìn)BMSCs的增殖及成骨分化。其具有來(lái)源廣泛,提取工藝簡(jiǎn)單,獲取便捷，費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn),是一種很有應(yīng)用前景的促進(jìn)骨缺損修復(fù)的中藥單體。近年來(lái)的研究顯示，ICA能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,促進(jìn)成骨細(xì)胞，抑制破骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)[14-15]。毛勇等應(yīng)用淫牟蕾昔與β-磷酸三鈣復(fù)合后修復(fù)兔橈骨骨缺損，12周后骨缺損完全愈合[16]。李慕勤等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石-絲素蛋白/殼聚糖/淫羊藿具有更好地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，其作為骨組織工程支架材料的可行性強(qiáng)[17]。寧兆榮等用脂肪干細(xì)胞復(fù)合載ICA-納米羥基磷灰石支架材料對(duì)兔下頜骨缺損進(jìn)行修復(fù)，12周后骨缺損修復(fù)良好[18]。本課題的設(shè)計(jì)基于以上思考，將CPP與ICA按比例混合后制成復(fù)合骨支架，CPP/ICA復(fù)合骨支架可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，期待用于骨缺損的修復(fù)。但是，該復(fù)合材料是否存在其他的化學(xué)反應(yīng)或生化變化，而不能用于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了體外生物相容性試驗(yàn)。

任何一種修復(fù)材料在應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)之前，首先應(yīng)評(píng)價(jià)其生物相容性。只有具備良好生物相容性的骨支架，才能在體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中，MG63細(xì)胞在CPP/ICA復(fù)合骨支架上生長(zhǎng)良好，呈梭狀生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)片狀生長(zhǎng)。與CPP/ICA復(fù)合骨支架浸提液培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)飽滿，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異有顯著性，且細(xì)胞毒性等級(jí)為0，證實(shí)CPP/ICA復(fù)合骨支架具有良好的生物相容性，可用于動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，具有良好的使用前景。