劉傳新，王海龍，吳秀瓊，劉斐燁

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州 510315；2.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300120)

最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，肺癌在癌癥相關(guān)死亡中仍占第一位[1]，尋找新的診斷治療靶點可能為研究新的治療方案提供方向。前列腺特異性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen，PSMA)是一種定位于11p11-p12的II型跨膜糖蛋白[2]，正常情況下，在前列腺、腎臟、小腸、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和唾液腺均有低水平表達(dá)[3]。PSMA在大部分前列腺癌細(xì)胞中呈過表達(dá)，且與腫瘤分期和病理分級有關(guān)[4]。近年來有研究顯示，PET/CT在甲狀腺癌、腎癌、胃腸間質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等實體瘤中也能檢測到PSMA攝取[5]。有文獻(xiàn)提及68GA-PSMA PET/CT能檢測到肺癌及其轉(zhuǎn)移部位中的PSMA攝取[6-7]，但PSMA在肺癌組織中的表達(dá)及與臨床特征的關(guān)聯(lián)國內(nèi)尚無報道。

新生血管是惡性腫瘤的一個重要標(biāo)志，抗血管靶向治療作為一種新的靶向治療方法近年來越來越受關(guān)注。有研究顯示，PSMA在胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞(Neovascular Endothelial Cells，NEC)中有表達(dá)[8-10]，提示PSMA可能是一個有前景的抗腫瘤血管生成治療靶點。PSMA在肺癌組織腫瘤細(xì)胞和NECs中的表達(dá)情況仍不明確。

本研究中，用免疫組織化學(xué)法檢測了PSMA在非小細(xì)胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC)組織中的表達(dá)，并且分析其與年齡、性別、臨床分期、病理類型、原發(fā)灶大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的關(guān)聯(lián)，初步探討PSMA在NSCLC中的表達(dá)及可能的作用。

1 資料與方法

1.1組織標(biāo)本:本研究共納入南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科2013年1月～2018年1月間行外科手術(shù)切除的159例NSCLC組織及42例對照癌旁肺組織標(biāo)本，均由病理確診，其中包括鱗癌57例，腺癌55例，大細(xì)胞癌47例。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1.2免疫組織化學(xué)法檢測:PSMA鼠抗人抗體、CD31鼠抗人抗體購自Abcam公司或Proteintech公司，羊抗鼠HRP-IgG抗體、DAB顯色試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后脫水、浸蠟、包埋后切成4μm厚的切片，隨后進(jìn)行烤片、脫蠟。梯度酒精水化后，加檸檬酸抗原修復(fù)液在120℃下抗原修復(fù)。隨后在H2O2中孵育10 min，PBS沖洗3次，5 min/次。加入PSMA單克隆抗體或CD31單克隆抗體，4℃過夜后PBS沖洗3次，室溫下加入羊抗鼠HRP-IgG抗體孵育40 min后，PBS沖洗3次，滴加新鮮配制的DAB顯色試劑。顯色3～5 min后，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染。酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

以CD31作為參照確認(rèn)PSMA在NECs中的表達(dá)。PSMA陽性的前列腺癌組織標(biāo)本作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。對于PSMA陽性的NSCLC組織標(biāo)本，再以另一PSMA單克隆抗體進(jìn)行復(fù)檢，以驗證實驗結(jié)果的可靠性。

免疫組化的結(jié)果判定分為兩種：陰性(免疫組化在細(xì)胞上沒有任何染色)，陽性(任何細(xì)胞上有確定的免疫組化染色，無論染色的強(qiáng)度如何)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析:實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0(SPSS 17.0, Chicago, IL, USA)統(tǒng)計學(xué)軟件分析。PSMA與年齡、性別、分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和病理類型的關(guān)系采用χ2檢驗來分析。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

159例NSCLC組織中，111例腫瘤組織的NECs表達(dá)PSMA，陽性率為69.81%，87例腫瘤組織的腫瘤細(xì)胞表達(dá)PSMA，陽性率為54.72%，71例呈NECs和腫瘤細(xì)胞雙陽性表達(dá)(44.65%)，40例僅在NECs呈表達(dá)陽性(25.16%)，16例僅在腫瘤細(xì)胞中呈表達(dá)陽性(10.06%)。所有癌旁肺組織的實質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中均未見PSMA表達(dá)。

腫瘤組織NECs的PSMA表達(dá)與臨床分期呈顯著相關(guān)。98例Ⅰ期和Ⅱ期患者中76例NECs表達(dá)PSMA(77.60%)，61例Ⅲ期和Ⅳ期患者中35例表達(dá)PSMA(57.40%)。Ⅰ期和Ⅱ期患者的陽性率要明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期的患者(P=0.007)。腫瘤細(xì)胞的PSMA表達(dá)與臨床分期未見明顯相關(guān)(表1，P=0.268)。

此外，如表1所示，NSCLC腫瘤細(xì)胞的PSMA表達(dá)與年齡顯著相關(guān)。年齡≥60歲的患者細(xì)胞表達(dá)PSMA的比例明顯多于年齡≥60歲的患者(66.20% vs 45.50% ，P=0.009)。而NECs的PSMA表達(dá)則與年齡無顯著關(guān)聯(lián)(P=0.113)。無論是腫瘤細(xì)胞或NECs，PSMA陽性率與患者性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)及病理類型均無明顯關(guān)聯(lián)。見表1。

表1 PSMA 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)[例(%)]

3 討論

PSMA首次發(fā)現(xiàn)于1987年，在LNCaP前列腺癌細(xì)胞株中獲取[2]。最初的研究發(fā)現(xiàn)，PSMA在正常前列腺組織中呈低表達(dá)，在前列腺癌中呈高表達(dá)，并隨著正常前列腺細(xì)胞向高級別前列腺上皮內(nèi)瘤變、前列腺癌進(jìn)展的過程表達(dá)升高[11]，與Gleason評分、PSA水平有顯著關(guān)聯(lián)[12]，因此曾被認(rèn)為是前列腺特異性表達(dá)的抗原。而進(jìn)一步的實驗提示，PSMA mRNA和蛋白在多種腫瘤中均有表達(dá)，包括胰腺癌、乳腺癌、腎癌等，證明PSMA并不是只在前列腺癌中特異性表達(dá)[13]。Chang等的研究發(fā)現(xiàn)，PSMA mRNA和蛋白在多種其他實體瘤的NECs上也有表達(dá)[14]。但PSMA并非在所有腫瘤的NECs上都表達(dá)，其在子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的表達(dá)要高于NECs[15]。筆者的研究首次發(fā)現(xiàn)，PSMA蛋白在腫瘤組織中表達(dá)陽性率比癌旁肺組織高，提示PSMA在NSCLC中也可能是一個輔助診斷標(biāo)志，支持Lars Henning Schmidt等人之前的研究[16]結(jié)論。但是，筆者收集的標(biāo)本中PSMA在NSCLC腫瘤細(xì)胞的表達(dá)率(53.46%)要高于前述研究中的6%，可能與實驗抗體不同、選擇人群不同有關(guān)，具體的機(jī)制原因值得進(jìn)一步研究。

PSMA的表達(dá)模式較為特殊，VEGF、endoglin和整合素等常見的血管靶點在正常組織和腫瘤組織的新生血管上均有表達(dá)，而PSMA則特異性表達(dá)于NECs，在正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞鮮有表達(dá)。這種在NECs表達(dá)的特異性可能與腫瘤新生血管的高度異型性相關(guān)。血管生成源自于內(nèi)皮細(xì)胞的激活[17]，NECs上具有可以選擇性激活PSMA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，但是在正常血管上不具有這種區(qū)域[18]。因此，PSMA更容易在NECs中被激活和特異性表達(dá)[19]。本研究再次證明，PSMA在NSCLC組織的NECs上特異性地表達(dá)，且在腫瘤細(xì)胞本身也有表達(dá)，提示PSMA有可能作為肺癌抗腫瘤新生血管治療的一個全新靶點，且可以同時針對腫瘤細(xì)胞和NECs發(fā)揮作用。

早期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PSMA表達(dá)與腫瘤分期和病理分級有關(guān)。PSMA mRNA在I期子宮內(nèi)膜癌中較其他分期升高，其表達(dá)降低低提示無疾病進(jìn)展期更短[15]。膀胱癌中PSMA mRNA與病理分級呈正相關(guān)，而PSMA mRNA表達(dá)降低也提示更高的2年生存率[20]。本文研究進(jìn)一步顯示，腫瘤NECs中的PSMA表達(dá)是與NSCLC腫瘤分期有關(guān)的因素，早期患者NECs的PSMA陽性率要明顯高于晚期患者，這一結(jié)論與軟組織腫瘤及前述NSCLC研究中數(shù)據(jù)類似[16, 21]。引起這一現(xiàn)象的原因可能是由于腫瘤早期快速增殖造成腫瘤內(nèi)部的缺氧[16]或腫瘤早期階段比晚期階段具有更多的新生血管。

此外，NSCLC腫瘤細(xì)胞本身的PSMA表達(dá)陽性率與年齡相關(guān)，<60歲的患者陽性率要明顯高于≥60歲的患者，可能由于年齡越小細(xì)胞代謝越旺盛，提示PSMA在NSCLC腫瘤細(xì)胞自身生長過程可能也發(fā)揮一定作用。無論是腫瘤細(xì)胞還是NECs的PSMA表達(dá)與患者性別、NSCLC的原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及病理分級均無明顯的相關(guān)性，其原因有待于今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究對PSMA在NSCLC組織中的表達(dá)和分布進(jìn)行了檢測和初步分析，發(fā)現(xiàn)PSMA在NSCLC的腫瘤細(xì)胞和NECs中均有表達(dá)，在對照的癌旁組織實質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均不表達(dá)，且NECs中的PSMA表達(dá)水平與患者臨床分期顯著相關(guān)，提示PSMA可能是NSCLC的一個診斷標(biāo)志和血管生成有關(guān)的治療靶點，其具體的作用和機(jī)制值得進(jìn)一步探索和分析。