趙品貞，陶冠軍，劉睿杰，常 明，金青哲，王興國

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

磷脂是一類帶有磷酸基團的甘油酯，廣泛存在于植物油料中。植物油料中的磷脂以磷脂酰膽堿 (PC)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)等甘油磷脂為主，同時還含有少量的溶血磷脂，即溶血磷脂酰膽堿 (LPC) 和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，不同來源的油料中磷脂組成各不相同[1]。近年來，油料中PC和PE被廣泛地研究和應(yīng)用，但其中的PI和溶血磷脂卻鮮有報道。有研究表明，PI可以直接參與許多細胞活動，對神經(jīng)突觸的延伸效果極佳，且具有良好的乳化性能[2-3]。溶血磷脂較甘油磷脂乳化性和抗氧化性更強，在食品、醫(yī)藥和畜牧業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，市場需求量逐漸增加[4-5]。此外，同類磷脂的不同分子種的功能也存在顯著差異，如二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)在預(yù)防脂肪肝病變和心血管疾病方面的效果更為顯著[6]。因此，系統(tǒng)研究不同油料中的磷脂結(jié)構(gòu)對開發(fā)不同需求的多樣化的磷脂高端產(chǎn)品具有非常重要的價值。

目前，常用的磷脂檢測技術(shù)有薄層色譜(TLC)[7]、核磁共振(31P-NMR)[8-9]、氣相色譜(GC)[10]、液相色譜(LC)[11]和質(zhì)譜(MS)[12-14]等，現(xiàn)有文獻中關(guān)于油料磷脂分析方法及結(jié)果見表1。前4種分析方法雖然操作相對簡單，但是分離效果不好，鑒定磷脂分子種的脂肪酸通常需要甲酯化或分離制備等預(yù)處理過程，且一般僅能分析樣品中磷脂的總脂肪酸組成，不能鑒定每種磷脂分子連接的脂肪酸種類，因而無法實現(xiàn)對磷脂結(jié)構(gòu)的精確分析。MS通常與LC(HPLC或UPLC)串聯(lián)可得到磷脂更為廣泛的分子結(jié)構(gòu)信息。MS離子源大多數(shù)采用基質(zhì)輔助激光解吸(Matrix-assisted laser desorption Ionization，MALDI)和電噴霧(Electrospray ionization，ESI)，前者分析磷脂需要煩瑣的樣品預(yù)處理和嚴(yán)苛的實驗條件，成本較高，因而 ESI較之使用更為廣泛。LC分為正相液相色譜(NPLC)和反相液相色譜(RPLC)兩種模式。近年來，一種非常適合于分離極性和親水性化合物的親水作用色譜(Hydrophilic interaction chromatography, HILIC)受到各個領(lǐng)域的關(guān)注[15]。HILIC具有與NPLC相似的保留性能，常使用水/水溶性有機相洗脫體系，克服了NPLC常采用非極性溶劑而與質(zhì)譜檢測器兼容性較差的缺陷[16]，且具有色譜柱滲透性好、反壓較低等優(yōu)勢，能基于磷脂親水頭極性的差異將不同類別的磷脂分開。此外，HILIC與RPLC有較好的選擇正交性，可進一步根據(jù)磷脂非極性尾與固定相之間的疏水相互作用力的差異來分離磷脂分子[17]。因此，結(jié)合這兩種分離模式，將能極大地提高磷脂的分離效果。同時，以串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測器，不需標(biāo)準(zhǔn)品即可實現(xiàn)磷脂分子種更準(zhǔn)確的定性定量分析，可直接得到磷脂分子側(cè)鏈結(jié)構(gòu)及其脂肪酸組成。

表1 油料磷脂的分析方法及結(jié)果

本文采用HILIC模式和RPLC模式相結(jié)合的串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF-MS)技術(shù)，對8種植物油料大豆、葵花籽、棉籽、油菜籽、亞麻籽、水飛薊籽、長柄扁桃仁、美藤果仁的磷脂輪廓進行了全面分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆、葵花籽、棉籽、油菜籽、亞麻籽、長柄扁桃仁、美藤果仁、水飛薊籽均為市售。

甲醇、氯仿、正己烷、乙醚、異丙醇和乙腈均為色譜純，美國TEDIA高純?nèi)軇┯邢薰?；氯化鉀和乙酸銨，國藥有限公司；氮氣和氬氣(純度均≥99.999%),太湖氣體有限公司。

ACQUITY UPLC、Q-TOF-MS，美國Waters公司；AB304-S型電子天平、SE812型氮吹儀、固相萃取柱(CNWBOND Si SPE Cartridge，1 g，6 mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總脂提取

參考Bligh[18]的方法進行總脂的提取。油料經(jīng)粉碎機粉碎后，于4℃保存。將10 g樣品與60 mL氯仿-甲醇溶液(體積比2∶1)混合，超聲20 min后，過濾得到澄清溶液，向溶液中加入13.5 mL 氯化鉀溶液(質(zhì)量濃度為0.88 g/100 mL)，將混合物于4 000 r/min 離心5 min。取下層有機相在氮氣流下吹干，得到油料的總脂。

1.2.2 固相萃取(Solid phase extraction，SPE)純化磷脂

參照Avalli等[19]的方法，利用SPE小柱純化磷脂。將約500 mg提取的總脂溶于1 mL氯仿-甲醇溶液(體積比2∶1)中。首先用3 mL正己烷活化小柱，然后上樣，依次用3 mL正己烷-乙醚(體積比8∶2)和3 mL正己烷-乙醚(體積比1∶1)洗脫弱極性脂和中性脂，最后用4 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水(體積比3∶5∶2)洗脫極性脂。將極性脂溶液在氮氣流下吹干，用甲醇溶解至溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，待進樣分析。

1.2.3 磷脂分析鑒定

1.2.3.1 HILIC條件

采用Xbridge-HILIC 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA)；柱溫45℃；進樣器溫度20℃；洗脫液A為乙腈，洗脫液B為10 mmol/L 乙酸銨溶液；梯度洗脫程序為0～2 min 90% A，2～18 min 90%～60% A，18～20 min 60%～90% A；流動相流速0.3 mL/min；進樣體積1 μL。

1.2.3.2 RPLC條件

采用BEH-C18 色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA)；柱溫45℃；進樣器溫度20℃；洗脫液A為異丙醇-乙腈(體積比90∶10)，洗脫液B為乙腈-水(體積比50∶50)；梯度洗脫程序為0～1 min 40% A，1～20 min 40%～100% A，20～25 min 100%～40% A；流動相流速0.3 mL/min；進樣體積1 μL。

1.2.3.3 MS條件

毛細管電壓和錐孔電壓分別為3.5 kV和30 eV；離子源溫度和脫溶劑氣溫度分別保持在100℃和400℃；脫溶劑氣流速為700 L/h。分別采用電噴霧電離源正離子(ESI+)和負離子(ESI-)掃描；采用全信息串聯(lián)質(zhì)譜(MSE)模式掃描，掃描時間和間隔掃描時間分別為0.2 s和0.02 s；低碰撞能量設(shè)置為6 eV，高碰撞能量范圍為20～30 eV；質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1 500。在分析過程中，使用亮氨酸腦啡肽(0.3 ng/μL)進行精確質(zhì)量校正(每30 s)，在正離子模式下亮氨酸腦啡肽m/z為556.277 1，在負離子模式下亮氨酸腦啡肽m/z為554.266 0。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用MassLynx V4.1(Waters，USA)對原始數(shù)據(jù)進行分析。使用Origin 9.1和Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同類型磷脂的分離

根據(jù)磷脂極性頭的差異，通過HILIC對不同類型的磷脂分子進行分離。以亞麻籽為例，其磷脂的總離子流圖見圖1。由圖1可知，磷脂在20 min之內(nèi)被洗脫，分離時間短，色譜峰分離度良好，結(jié)合質(zhì)譜信息即可確認磷脂種類并得到同一類型磷脂中的不同分子的準(zhǔn)分子離子的m/z。在洗脫過程中，磷脂的洗脫時間在2.0～14.0 min之間，洗脫順序為PI、PE、LPE、PC和LPC，其保留時間分別為：PI 3.30～4.20 min，PE 8.80～9.20 min，LPE 10.00～10.75 min，PC 10.75～12.00 min，LPC 12.50～13.50 min。

圖1 亞麻籽中磷脂的總離子流圖

2.2 不同磷脂分子種的分離鑒定

通過HILIC-Q-TOF-MS得到PC、PE、PI、LPC和LPE準(zhǔn)分子離子的m/z，再結(jié)合C18色譜、MSE掃描模式得到的碎片信息，準(zhǔn)確鑒定不同磷脂分子的結(jié)構(gòu)。圖2列出了亞麻籽(圖2A)、葵花籽(圖2B)、油菜籽(圖2C)和水飛薊籽(圖2D)PC的提取離子色譜圖。由圖2可知，8.0～16.0 min為不同種類的PC。C18色譜柱的優(yōu)勢在于可使同一類型磷脂分離出3個以上的峰譜，隨后根據(jù)其質(zhì)譜圖分析磷脂分子脂肪酸結(jié)構(gòu)。磷脂分子洗脫的順序與脂肪酸當(dāng)量碳數(shù)(ECN)(ECN=總碳數(shù)-總雙鍵數(shù)×2)有關(guān)，保留時間隨著ECN的增加而延長，如亞麻籽PC分子的洗脫順序從前到后依次為ECN24、26、28、30、32、34。值得注意的是磷脂同分異構(gòu)體也被分開，例如亞麻籽PC 36∶3的18∶1-18∶2和18∶0-18∶3兩種磷脂分子(圖2A)以及葵花籽PC 36∶2的兩種結(jié)構(gòu)18∶1-18∶1和18∶0-18∶2均可分開(圖2B)。此方法分離效果好、靈敏度高，一些含量較低的磷脂分子也得到了鑒定，如油菜籽PC 18∶2-22∶0 分子。

圖2 亞麻籽(A)、葵花籽(B)、油菜籽(C)、水飛薊籽(D)PC的提取離子色譜圖

圖3 亞麻籽PC 18∶1-18∶0的低能量(A)和高能量(B)ESI+質(zhì)譜圖

PI在ESI+和ESI-模式下均有響應(yīng)，在ESI+條件下，PI形成[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰；在ESI-條件下，PI形成[M-H]-離子，在高能量下產(chǎn)生m/z約241的特征碎片離子 [C6H10O8P]-，同時磷脂酰基端斷裂產(chǎn)生[RCOO]-的碎片離子以及[M-H-RCOOH]-。以棉籽PI中1個色譜峰為例：低能量狀態(tài)下(圖4A)的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z833.559 9，確定其相對分子質(zhì)量為834；高能量狀態(tài)下(圖4 B)的4個碎片離子峰[C3H5O5P]-、[C6H10O8P]-、[M-H-C16H32O2]-、[M-H-C18H32O2]-分別為m/z152.993 7、241.005 8、553.267 7、577.288 9，確定其為一種PI分子，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)為34∶2，計算得到脂肪酸的相對分子質(zhì)量為256、280，分別對應(yīng)棕櫚酸和亞油酸，故此磷脂為PI 16∶0-18∶2。

圖4 棉籽PI 16∶0-18∶2的低能量(A)和高能量(B)ESI-質(zhì)譜圖

2.3 8種植物油料的磷脂組成

通過以上方法檢測，采用面積歸一化法計算磷脂含量，8種植物油料中磷脂分子的組成及相對含量見圖 5。由圖5可知，油料中PE、PC和PI的含量最為豐富，大豆、葵花籽、棉籽中磷脂含量順序是PE>PC>PI，這與文獻[20]結(jié)果一致。值得關(guān)注的是，油菜籽((27.8±3.48)%)、長柄扁桃仁((26.31±2.08)%)和美藤果仁((23.77±1.40)%)中的PI含量較高，均超過大豆((21.25±1.85)%)。因此，油菜籽、長柄扁桃仁和美藤果仁可考慮作為提供PI的油料原料。對比其他油料，棉籽和亞麻籽的溶血磷脂(LPC和LPE)含量較高，分別為(10.26±1.58)%和(10.93±0.41)%，高于大豆((4.24±0.12)%)，另外在葵花籽和油菜籽中未發(fā)現(xiàn)溶血磷脂。

注：1.葵花籽；2.美藤果仁；3.大豆；4.油菜籽；5.水飛薊籽；6.長柄扁桃仁；7.棉籽；8.亞麻籽。圖5 油料的磷脂種類及含量

對8種植物油料的5類磷脂的分子種進行了分析，結(jié)果如表2所示。與Imbs[21]、Beermann[22]、Wang[23]等的研究相比，除PC和PE之外，本文還實現(xiàn)了對PI、LPC和LPE的分離鑒定，并確定了其脂肪酸組成。由表2可知，8種植物油料中PC和PE的脂肪酸組成多以棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸為主，另外，多種油料的PC中含有少量的硬脂酸以及油菜籽的PC中含有少量的山崳酸。8種油料的PC和PE分子種組成基本相似，分別以PC18∶1-18∶2、PC18∶2-18∶2和PE16∶0-18∶2、PE18∶2-18∶2為主。而油料的PI和溶血磷脂(LPC和LPE)分子種組成差異明顯，油菜籽的PI以16∶0-18∶2((26.53±2.56)%)和18∶1-18∶2((28.29±2.45)%)為主，長柄扁桃仁的PI以16∶0-18∶1((56.10±3.96)%)為主，美藤果仁的PI以16∶0-18∶2((24.83±2.37)%)和18∶2-18∶2((19.13±0.21)%)為主。棉籽的溶血磷脂脂肪酸組成以亞油酸為主，LPC 18∶2和LPE 18∶2占比分別為(49.39±2.67)%和(47.17±3.30)%。亞麻籽的溶血磷脂脂肪酸以油酸為主，LPC 18∶1和LPE 18∶1占比分別為(38.34±2.94)%和(26.49±1.21)%。

表2 8種油料的磷脂分子種及含量

3 結(jié) 論

聯(lián)合應(yīng)用HILIC-Q-TOF-MS與RPLC-Q-TOF-MS技術(shù)快速準(zhǔn)確地分析了8種植物油料的磷脂組成。結(jié)果表明，8種油料的PC和PE分子種組成基本相似，分別以PC18∶1-18∶2、PC18∶2-18∶2和PE16∶0-18∶2、PE18∶2-18∶2為主。PI和溶血磷脂(LPC和LPE)分子種組成差異明顯，油菜籽((27.8±3.48)%)、長柄扁桃仁((26.31±2.08%))和美藤果仁((23.77±1.40)%)的PI含量均高于大豆((21.25±1.85)%)，這3種油料可作為PI的新型來源。油菜籽的PI以16∶0-18∶2和18∶1-18∶2為主，長柄扁桃仁的PI以16∶0-18∶1為主，美藤果仁的PI以16∶0-18∶2和18∶2-18∶2為主。棉籽和亞麻籽的溶血磷脂含量較高，其中棉籽溶血磷脂的脂肪酸組成以亞油酸為主，亞麻籽中則以油酸為主。

本文采用HILIC色譜，使用乙腈和水為流動相，與質(zhì)譜檢測器兼容性更好，分離效果極佳，靈敏度高，能同時分離鑒定出PC、PE、PI、LPC和LPE，使定性分析和定量分析更為準(zhǔn)確，并通過C18反相色譜柱分離出磷脂的同分異構(gòu)體。此外，本文采用MSE掃描模式，樣品不需要進行甲酯化等復(fù)雜預(yù)處理，根據(jù)得到的準(zhǔn)分子離子和碎片離子信息直接推斷油料磷脂脂肪酸組成。PC和LPC的特征碎片離子為[HPO4(CH2)2N(CH3)3]+，PE和LPE的特征碎片離子為[M+H-C2H8NO4P]+，PI的特征碎片離子為[C6H10O8P]-。本研究可為植物油料中磷脂的分離分析提供新方法，為油料中具有特殊生理功能的磷脂產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。