劉 超,何衛(wèi)保,朱桐林,劉糧澤,高鑫芯,高慧婕

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 山東 日照 276826)

近年來，隨著我國人民生活水平的逐漸提高，我國居民的食用油年消費(fèi)量已經(jīng)達(dá)到24.8 kg，平均每天攝入量約為68 g，已經(jīng)超過推薦用量的2倍[1-2]。高脂、高能量食物的攝入比例增加，血脂異常人群的總體患病率呈快速上升趨勢(shì)，主要表現(xiàn)為高脂血癥[3]。眾所周知，心血管疾病是導(dǎo)致全球人口死亡率上升的重要原因，而高脂血癥是引發(fā)心血管疾病的首要危險(xiǎn)因素[4-7]。程序性死亡受體1 (Programmed cell death protein 1 ，PD-1)是一種重要的免疫抑制分子。PD-1與其配體PD-L1主要通過協(xié)同刺激作用抑制T 細(xì)胞的活化與增殖，下調(diào)免疫應(yīng)答。近年來PD-1被認(rèn)為與移植排斥、自身免疫性疾病、慢病毒感染、腫瘤免疫逃逸等多種疾病密切相關(guān)[8-10]。若阻斷PD-1與PD-L1信號(hào)途徑，自身反應(yīng)性T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控信號(hào)缺失，從而致自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆增殖，從而可引發(fā)自身免疫炎癥反應(yīng)?，F(xiàn)已知高脂血癥與免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而有關(guān)PD-1與高脂血癥關(guān)系的研究，國內(nèi)外均未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥大鼠，探討PD-1在高脂血癥大鼠體內(nèi)的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只清潔級(jí)雄性SD大鼠，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，合格證號(hào)為SCXK(魯)2014-0007，6周齡，體重160～180 g。

1.1.2 試劑

4%多聚甲醛通用性組織固定液，Biosharp公司；Total RNA Extractor(Trizol)，上海生工生物工程公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；總膽固醇(T-CHO)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Filter Max型多功能酶標(biāo)儀，美國美谷分子儀器有限公司； T100TMThermal Cycler PCR儀、CFX96TMOptics Module熒光定量PCR儀，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；MIX-1500型微孔板振蕩儀，杭州米歐儀器有限公司；可調(diào)速旋渦混勻器，蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HW.SY11-K型電熱恒溫水浴箱，北京長風(fēng)儀器儀表公司；RM2235切片機(jī)，德國萊卡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

將40只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(溫度保持在20～25℃，濕度維持在50%～55%，每天給普通飼料少量多次，保證晝夜交替均12 h)后，測(cè)量大鼠體重并隨機(jī)分為高脂飼料組和普通飼料組各20只。每日早、中、晚分3次給予飼料，普通飼料組每只大鼠日均給料25 g，高脂飼料組每只大鼠日均給料20 g，共計(jì)飼養(yǎng)12周[11-13]。普通飼料配方：面粉25%，麥片25%，玉米面25%，豆面10%，魚粉8%，骨粉4%，酵母粉2%，精鹽1%。高脂飼料配方：普通飼料47.7%，豬油15%，蛋白粉12%，全脂奶粉8%，白砂糖8%，膽固醇7%，膽鹽0.3%，食鹽2%[8]。

大鼠飼養(yǎng)12周后，禁食12 h，逐一稱重。腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠。大鼠采血，測(cè)定血糖后靜置10 min， 2 500 r/min 離心10 min，分離獲得大鼠血清，放置在-80℃保存待用。然后解剖大鼠分離肝臟、脾臟和胰腺。選擇每只大鼠的部分肝臟，使用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，剩余臟器迅速分裝至冷凍管中，置入-80℃保存。

1.2.2 大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)的測(cè)定

大鼠解剖后，分離的肝臟、脾臟和胰腺，使用生理鹽水沖洗表面殘留血液，吸水紙吸干殘余液體后，用精密天平稱重，按下式計(jì)算臟器指數(shù)。

肝臟(脾臟、胰腺) 指數(shù)=肝臟(脾臟、胰腺)質(zhì)量/大鼠體重×100%

1.2.3 大鼠血清TG、T-CHO、 LDL-C和HDL-C含量的測(cè)定

將分離的大鼠血清從-80℃冰箱取出，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，加樣后的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，測(cè)定各孔吸光度。按照給定的公式計(jì)算各生化指標(biāo)的含量。

1.2.4 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠肝臟、脾臟和胰腺PD-1 mRNA的表達(dá)

Trizol法提取大鼠肝臟、脾臟和胰腺組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green在CFX96擴(kuò)增儀上進(jìn)行熒光定量PCR。 PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5 大鼠肝臟HE染色

大鼠肝臟組織石蠟包埋，切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5～6 μm，在60℃溫水中用載玻片進(jìn)行粘片，高溫烤片90 min，隨后脫蠟水化、蘇木精-伊紅染色，全景掃描儀掃描觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體重和臟器質(zhì)量的變化(見表2)

表2 大鼠體重和各臟器質(zhì)量(n=20)

實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠均未出現(xiàn)死亡，活動(dòng)度與攝食情況均未見異常。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(飼喂高脂飼料之前)，普通飼料組與高脂飼料組大鼠體重?zé)o明顯差異(p>0.05)。由表2可知，飼養(yǎng)12周后，高脂飼料組大鼠體重顯著高于普通飼料組(p<0.05)。與普通飼料組相比，高脂飼料組大鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)顯著增加(p<0.05)。提示高脂血癥可能造成了大鼠各臟器的免疫炎癥反應(yīng)，尤以胰腺指數(shù)增加最為顯著。

2.2 大鼠血糖和血清TG、T-CHO、LDL-C和 HDL-C的變化(見表3)

表3 大鼠生化指標(biāo)(n=20)

由表3可知，與普通飼料組相比， 高脂飼料組大鼠的血糖和血清中TG、T-CHO、 LDL-C含量均顯著高于普通飼料組(p<0.05)，高脂飼料組LDL-C/HDL-C的比值也顯著高于普通飼料組(p<0.05)，證明此次高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠造模成功。

普通飼料組 高脂飼料組圖1 大鼠肝臟HE染色

2.3 大鼠肝臟HE染色(見圖1)

由圖1可知：HE染色后，鏡下觀察可見普通飼料組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，染色均勻分布，細(xì)胞排列整齊、清晰，細(xì)胞核處于細(xì)胞中央；高脂飼料組大鼠肝臟組織發(fā)生了脂肪變性，出現(xiàn)了大小不等的脂肪空泡，細(xì)胞核被擠壓于細(xì)胞一側(cè)。

2.4 大鼠肝臟、脾臟和胰腺組織中PD-1 mRNA的表達(dá)(見圖2)

由圖2可知，與普通飼料組相比，高脂飼料組大鼠的肝臟、脾臟及胰腺組織內(nèi)PD-1 mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

注：*表示與普通飼料組比較p<0.05。圖2 大鼠肝臟、脾臟和胰腺組織中PD-1 mRNA的表達(dá)

2.5 討論

高脂血癥是引發(fā)腦卒中、心肌梗死、心源性猝死等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素，對(duì)身體的損害是隱匿、進(jìn)行性和全身性的，最終可引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、腎功能衰竭等[6-7]。大量研究表明， 肥胖、高脂高糖飲食、過度飲酒等都是促成高脂血癥患病率逐年升高、患病年輕化的危險(xiǎn)因素[14]。實(shí)驗(yàn)使用高脂飼料誘導(dǎo)高脂血癥大鼠，高脂飲食12周后，大鼠血清中TG、T-CHO、LDL-C含量及LDL-C/HDL-C的比值均顯著高于普通飼料組， HE染色也顯示高脂飼料組大鼠肝臟組織發(fā)生了脂肪變性，說明長期高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠高脂血癥的發(fā)生。

機(jī)體的高脂血癥狀態(tài)必然對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一系列影響，而高脂血癥與免疫炎癥反應(yīng)是密切相關(guān)的。有研究發(fā)現(xiàn)，人體血清中膽固醇的升高會(huì)引起白細(xì)胞及單核細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，同時(shí)高膽固醇血癥可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化和血小板計(jì)數(shù)的增加[15-16]。血脂升高能夠?qū)е?T細(xì)胞亞群比例的變化[17-19]，血脂升高可引發(fā)CD8+T 細(xì)胞與 CD4+T 細(xì)胞的比值升高，而介導(dǎo)免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞(Treg細(xì)胞)減少，創(chuàng)造了一個(gè)適合于免疫激活的環(huán)境。PD-1/PD-L1是表達(dá)于T細(xì)胞表面的重要免疫抑制分子，PD-1/PD-L1的激活使得Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，致使免疫功能下降；而阻斷PD-1/PD-L1通路，可使CD8+T細(xì)胞的活性升高，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在組織纖維化水平較高的地方和具有炎癥效應(yīng)的患者中表達(dá)較高，PD-L1表達(dá)量和肝臟的纖維化程度和炎癥效應(yīng)的強(qiáng)弱呈正相關(guān)性，PD-L1高表達(dá)有可能誘導(dǎo)機(jī)體長時(shí)間維持免疫耐受的狀態(tài)，對(duì)肝組織的纖維化進(jìn)展產(chǎn)生促進(jìn)效果[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高脂血癥大鼠體內(nèi)，其肝臟、脾臟及胰腺內(nèi)PD-1的表達(dá)均較正常大鼠顯著降低。因此，推測(cè)高脂血癥大鼠體內(nèi)PD-1的表達(dá)降低，PD-1/PD-L1通路處于抑制狀態(tài)，提高了機(jī)體CD8+T細(xì)胞的活性，從而使機(jī)體處于免疫激活的狀態(tài)，引發(fā)炎癥，參與了高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展。后續(xù)將展開進(jìn)一步研究，觀察高脂血癥大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)以及炎癥與PD-1表達(dá)變化的相關(guān)性，進(jìn)一步探討PD-1對(duì)高脂血癥的調(diào)節(jié)機(jī)制。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂血癥大鼠模型制備成功：高脂飼料組大鼠的肝臟、脾臟和胰腺指數(shù)顯著高于普通飼料組；高脂飼料組大鼠的血糖和血清中的TG、T-CHO、LDL-C含量以及LDL-C/HDL-C的比值均顯著高于普通飼料組；HE染色顯示高脂飼料組大鼠肝臟組織內(nèi)均出現(xiàn)明顯脂肪空泡。高脂、高能量食物的攝入比例增加，是促成高脂血癥的危險(xiǎn)因素。另外，與普通飼料組相比，高脂飼料組大鼠的肝臟、胰腺和脾臟組織內(nèi)PD-1 mRNA的表達(dá)均顯著降低，提示PD-1可能參與了高脂血癥的發(fā)生和發(fā)展。