楊宏黎，竇義蓮，韓琳娜，肖志剛, 3，阮有志，韓 旭

(1.沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院，沈陽 110034； 2.朝陽師范高等專科學(xué)校 生化工程系，遼寧 朝陽 122000；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 哈爾濱 150038)

阿魏酸是廣泛存在于多種植物中的一種酚酸，其在中草藥原料如阿魏、當(dāng)歸等植物的葉、莖、根中含量較高，同時(shí)在食品原料如米糠和麥麩中含量也較高[1- 3]。阿魏酸是一種天然的抗氧化劑，同時(shí)還具有清除自由基、保護(hù)細(xì)胞、抑制血栓素釋放、抗癌、抗菌消炎等功能。但由于阿魏酸在油相和水相體系中的溶解度都較低，很難滲透進(jìn)入生物質(zhì)細(xì)胞膜發(fā)揮其功能，因此阿魏酸衍生物的制備得到廣泛關(guān)注。

三丁酸甘油酯是一種無色油狀的短鏈脂肪酸，廣泛存在于藥物中，具有低黏度、低熔點(diǎn)、低熱量的功能特性。此外，在藥理學(xué)及營養(yǎng)學(xué)方面，三丁酸甘油酯已被證實(shí)具有修復(fù)小腸絨毛，抑制腸道有害菌的功效，并且對(duì)多種癌細(xì)胞如前列腺癌、乳腺癌等細(xì)胞增殖具有抑制作用[4-5]。

將阿魏酸分子結(jié)合至三丁酸甘油酯可有效改善其脂溶性和水溶性。由于阿魏酸為熱敏性物質(zhì)，生物催化以其反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、可降低反應(yīng)對(duì)底物的損害等優(yōu)點(diǎn)[6-9]，被廣泛應(yīng)用于阿魏酸衍生物的制備。

本課題前期研究中以甲苯為反應(yīng)介質(zhì)合成阿魏酰丁酸酯，但甲苯具有毒性。被稱為“綠色溶劑”的離子液體，具有蒸氣壓低、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。離子液體作為環(huán)境友好溶劑替代傳統(tǒng)揮發(fā)性有機(jī)溶劑具有廣闊前景。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，探究了在離子液體-甲苯溶劑體系中酶催化合成阿魏酰丁酸酯工藝，研究了各因素對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響，優(yōu)化了反應(yīng)條件，以期為阿魏酰丁酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

阿魏酸乙酯(EF，純度>99%)，購自蘇州常通化學(xué)有限公司；三丁酸甘油酯(TB,純度>95%)，購自阿拉丁試劑有限公司；3 ?分子篩，購自上海環(huán)球分子篩有限公司；固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme TL IM，購自諾維信公司上海分公司；甲苯、丙酮、甲醇、冰醋酸、乙腈、乙醇，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；[EMIM][TF2N]，[OMIM][PF6]，[HMIM][BF4]，[BMIM][PF6]，[BMIM][BF4]等離子液體均購自西格瑪(上海)貿(mào)易有限公司。

JD2000-2L型電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；氣浴搖床，順華儀器股份有限公司；SH23-2恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；LC1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；TKRE-1000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，天津市天科玻璃儀器制造有限公司；JW-1042型低速離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阿魏酰丁酸酯的制備

取2 mL甲苯，按一定溶劑配比滴加離子液體。將溶劑置于反應(yīng)容器中形成穩(wěn)定的溶劑體系，加入反應(yīng)的原料三丁酸甘油酯與阿魏酸乙酯，之后再加入一定量的脂肪酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，在一定溫度下空氣浴振蕩反應(yīng)一段時(shí)間。反應(yīng)體系在加酶前用分子篩(50 mg/mL)除水48 h。反應(yīng)后過濾除去脂肪酶和分子篩，剩余混合物通過柱層析(硅膠柱，層析液體為正己烷-甲醇)分離純化。脂肪酶催化阿魏酸乙酯與三丁酸甘油酯酯化反應(yīng)原理見圖1。

圖1 脂肪酶催化阿魏酸乙酯與三丁酸甘油酯酯化反應(yīng)原理

1.2.2 阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

采用高效液相色譜法對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率進(jìn)行測(cè)定。液相色譜條件：ZorbaxODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；UV/DAD檢測(cè)器；柱溫30℃；流動(dòng)相由冰醋酸-水(體積比3∶100，A)和乙腈(B)組成，洗脫程序?yàn)?～10 min，B由10%升至70%，10～20 min，B維持在70%，20～20.5 min，B由70%降至10%；流速1 mL/min；檢測(cè)波長325 nm；進(jìn)樣量10 μL。

阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率=(1,(3)-阿魏酰丁酸甘油酯峰面積+1,(3)-阿魏酰雙丁酸甘油酯峰面積)/總峰面積×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS18.0和Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析；P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溶劑體系對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

前期對(duì)有機(jī)溶劑的篩選中發(fā)現(xiàn)，甲苯既可以溶解阿魏酸乙酯又可以溶解三丁酸甘油酯而成為該反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)。但甲苯具有一定的毒性，將譽(yù)為“綠色溶劑”的離子液體引入化學(xué)反應(yīng)，可有效降低反應(yīng)的毒性。由此，對(duì)離子液體-甲苯溶劑體系進(jìn)行了篩選，考察溶劑體系對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見表1。

表1 溶劑體系對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響

從表1可以看出，不同溶劑體系下的阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率不同。由于離子液體具有一定的黏度，作為反應(yīng)介質(zhì)還需與甲苯同時(shí)使用，以減小黏度。在[HMIM][BF4]-甲苯、[BMIM][PF6]-甲苯和[BMIM][BF4]-甲苯3種體系中，沒有產(chǎn)物的生成。可能是由于脂肪酶Novozym 435在以上離子液體中的存在狀態(tài)不同，不能發(fā)揮催化特性。在[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系中阿魏酰丁酸酯的轉(zhuǎn)化率最高，顯著高于單獨(dú)以甲苯為反應(yīng)介質(zhì)的。因此，選取[EMIM][TF2N]-甲苯為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)介質(zhì)。

2.1.2 脂肪酶種類對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

生物催化劑脂肪酶應(yīng)用越來越廣泛，選擇固定化脂肪酶Lipozyme TL IM和Novozym 435進(jìn)行酯化反應(yīng)，考察脂肪酶種類對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，兩種脂肪酶均能催化阿魏酰丁酸酯的生成，但是反應(yīng)體系中兩種酶的催化活性不同。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，脂肪酶Novozym 435催化的反應(yīng)，在反應(yīng)6 d時(shí)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到65.54%，明顯高于脂肪酶Lipozyme TL IM催化的反應(yīng)。因此，選用Novozym 435進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)，在反應(yīng)6 d后，阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率不再有顯著提高，因此選取反應(yīng)時(shí)間為6 d。

注：底物摩爾比5∶1，酶添加量50 mg/mL，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，溶劑配比1∶2，反應(yīng)溫度50℃。圖2 脂肪酶種類對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響

2.1.3 溶劑配比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

甲苯和離子液體的配比不同，對(duì)反應(yīng)的影響也不同，因此考察了不同溶劑配比對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖3。

注：脂肪酶Novozym 435，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，底物摩爾比5∶1，酶添加量50 mg/mL，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6 d。圖3 溶劑配比對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響

從圖3可以看出，隨著溶劑配比由1∶3升至1∶1，阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率由59.24%提高至71.24%，這可能是由于離子液體中的陰、陽離子可提高酶催化效率。但隨著離子液體[EMIM][TF2N]占比繼續(xù)增大，阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率不再有顯著升高，這可能與離子液體的黏度有關(guān)，離子液體的添加量增加，反應(yīng)體系的黏度增加，降低了酶催化效率。因此，選擇溶劑配比為1∶1。

2.1.4 底物摩爾比對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

考察了不同的底物摩爾比對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出：隨著底物摩爾比從1∶1增加至3∶1，阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率有很大的提高；但當(dāng)?shù)孜锬柋扔?∶1升至6∶1時(shí)，阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率變化較小，這可能是由于底物的量已趨于飽和。因此，從經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，選擇最佳底物摩爾比為3∶1。

注：脂肪酶Novozym 435，酶添加量50 mg/mL，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，溶劑配比1∶2，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6 d。圖4 底物摩爾比對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在脂肪酶Novozym 435為催化劑、酶添加量50 mg/mL、[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，[EMIM][TF2N]與甲苯質(zhì)量體積比1∶1條件下，以底物摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間為因素，以阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析

由表2和表3可知，各因素對(duì)阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率影響大小依次為A>B>C，最佳工藝組合為A2B1C2，即底物摩爾比3∶1，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間6 d。在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，阿魏酰丁酸酯的轉(zhuǎn)化率為76.24%。

3 結(jié) 論

采用離子液體-甲苯溶劑體系酶法合成阿魏酰丁酸酯。通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)得到阿魏酰丁酸酯的最佳合成工藝條件為：以脂肪酶Novozym 435為催化劑，酶添加量50 mg/mL，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，[EMIM][TF2N]與甲苯質(zhì)量體積比1∶1，反應(yīng)溫度50℃，底物摩爾比3∶1，反應(yīng)時(shí)間6 d。在最佳反應(yīng)條件下，阿魏酰丁酸酯轉(zhuǎn)化率為76.24%。