顏 云, 郭玉蓮, 王成海, 3

(1. 揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科, 江蘇 揚(yáng)州, 225009;2. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 病理學(xué)教研室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009;3. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

大腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，是導(dǎo)致死亡的重要原因[1]。絕大多數(shù)大腸癌患者最終死于無(wú)法控制的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2-3]。環(huán)狀核糖核酸(circ-RNA)是一種共價(jià)閉環(huán)或者腺苷尾巴的非編碼蛋白R(shí)NA。研究[4-5]表明circ-RNA參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，如肺癌組織中circ-13958的表達(dá)明顯上調(diào)，已成為一種新的肺癌促癌基因[6]。circ-MTO1可促進(jìn)p21表達(dá)并抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[7]。circ-92509作為一種促癌基因，可通過(guò)結(jié)合miR-448促進(jìn)骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。本研究采用RNA原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)環(huán)狀核糖核酸92400(circ-92400)在大腸腺癌組織及癌旁正常腸組織中的表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020 年3月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院102例大腸腺癌組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的正常腸黏膜組織標(biāo)本，患者年齡 38～75 歲，中位年齡49歲; 男56例，女46例。所有大腸癌患者術(shù)前均未行放射治療和藥物治療。腺癌病理學(xué)類型經(jīng)病理醫(yī)師確診。標(biāo)本使用及臨床病理參數(shù)的收集整理均經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。 采集新鮮大腸腺癌組織后立即置于液氮罐里長(zhǎng)期保存待用。

1.2 RNA原位分子雜交實(shí)驗(yàn)

circ-92400 RNA探針和原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢BOSTER生物工程有限公司。主要實(shí)驗(yàn)步驟: 將厚度5 μm病理切片按常規(guī)方法石蠟脫水。使用胃蛋白酶消化切片并暴露切片組織中RNA核酸片段。預(yù)雜交后使用RNA探針進(jìn)行雜交，在42 ℃恒溫箱里放置12 h, 加過(guò)氧化氫封閉液后滴加一抗(生物素化鼠或兔抗地高辛)1 h, 然后滴加二抗(鏈霉親和素-生物素復(fù)合物)，最后滴加生物素化過(guò)氧化物酶。使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)呈棕黃色顯色，流水中止后用蘇木素將細(xì)胞核對(duì)比染成藍(lán)色，烘干透明封片，光鏡下觀察。

染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn): 細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為circ-92400陽(yáng)性細(xì)胞; 光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率, <1%為陰性, 1%～100%為陽(yáng)性。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，不加一抗的染色組織為陰性對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用Graph Pad Prism6 軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 circ-92400在大腸腺癌組織中的表達(dá)情況

RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 102例大腸腺癌組織中circ-92400 的染色表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，呈現(xiàn)為大小不等、著色深淺不同的棕黃色顆粒，為陽(yáng)性表達(dá); 其在癌旁正常腸黏膜組織中幾乎沒(méi)有棕黃色顆粒表達(dá)，為陰性表達(dá)。見(jiàn)圖1。circ-92400 在大腸腺癌組織中的陽(yáng)性細(xì)胞百分比數(shù)值為(58.00±13.00)%, 高于癌旁正常腸組織的(11.00±3.00)%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.84,P<0.05)。

2.2 circ-92400的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在102例大腸腺癌組織中, circ-92400的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、分化程度有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 與年齡、性別、肥胖、腫瘤直徑、腫瘤分級(jí)均無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

大腸癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，與高脂低膳食纖維飲食習(xí)慣、吸煙、嗜酒、炎性腸病等因素有關(guān)。目前大腸癌的致病機(jī)制尚未明確。SANGER H L等[9]在病毒中發(fā)現(xiàn)一種與線性 RNA不同的單鏈環(huán)狀RNA, 命名為circRNA。研究[10]表明, circRNAs作為一類廣泛而多樣的內(nèi)源性RNA, 可以調(diào)節(jié)編碼基因和非編碼基因的表達(dá)，如大腸癌組織中circ-20397與miR-138 表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，其參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。circRNAs能以外泌體的形式存在于微囊泡中，完成細(xì)胞與細(xì)胞間的信息傳遞[11-12]。circ-KLDHC10在大腸癌患者血液中的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，有望成為診斷大腸癌的新型檢測(cè)分子[13]。circ-12673和circ-MAN2B2可通過(guò)海綿吸附相關(guān)的微小RNA解除其對(duì)下游靶基因的抑制作用，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖[14-15]。三陰性乳腺癌組織中circ-EPSTI1 能通過(guò)海綿體抑制miR-4753/6809, 促進(jìn)BCL11A的蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖和凋亡，為臨床提供新的治療靶點(diǎn)[16]。circ-181在胃癌組織和血漿中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤病理分期和癌胚抗原(CEA)表達(dá)密切相關(guān)[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)circ-78710對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲有很好的促進(jìn)作用。circ-67934在宮頸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，而沉默circ-67934 表達(dá)后則會(huì)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[19]。

A: circ-92400在大腸腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒; B: circ-92400在癌旁正常腸黏膜組織中呈陰性表達(dá)。

表1 circ-92400在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床病理意義

本研究采用RNA原位分子雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在102例大腸腺癌組織中circ-92400呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，為77.45% (79/102), 并用陽(yáng)性細(xì)胞百分比證實(shí)circ-92400在大腸腺癌組織中的表達(dá)量高于癌旁正常組織中的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 提示circ-92400可能是一種新的促癌基因，參與了大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本研究結(jié)果還表明，大腸腺癌患者circ-92400陽(yáng)性表達(dá)率越高，則腫瘤瘤體越大，分化程度越低，淋巴結(jié)越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，以及TNM 分期越高，提示circ-92400陽(yáng)性率與患者預(yù)后結(jié)局有相關(guān)性, circ-92400的陽(yáng)性表達(dá)對(duì)大腸腺癌的診斷、轉(zhuǎn)移和預(yù)后評(píng)估有一定的價(jià)值。

綜上所述，大腸腺癌組織中circ-92400呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、分化程度密切相關(guān)，circ-92400或可作為大腸腺癌的新的腫瘤標(biāo)志物。