李衛(wèi)錦，張靜文 ，袁長春，張 穎，

（1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048；2.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/熱帶島嶼生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158）

【研究意義】紅樹林是重要的海洋資源，紅樹植物具有較強(qiáng)的耐潮汐能力，多分布在熱帶、亞熱帶海岸。紅樹林在沿海生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但紅樹植物與陸生植物相比種類極少［1］。隨著全球經(jīng)濟(jì)和環(huán)境的影響［2-3］，紅樹植物瀕危程度增加。引起紅樹物種瀕危的原因有植物長期進(jìn)化的內(nèi)在因素以及一些外部因素。其中，有性生殖障礙是影響物種瀕危的重要原因之一。紅欖李〔Lumnitzera littorea（Jack.）Voigt〕為使君子科（Combretaceae）非胎生紅樹植物，分布于印度、斯里蘭卡、緬甸、馬來西亞、泰國和我國的海南［1,4］。由于自然界和人類活動(dòng)的影響，該物種的種群出現(xiàn)高度破碎化并持續(xù)受到高度干擾［5］。在我國，紅欖李僅自然分布于海南的三亞和陵水，由于分布區(qū)域狹小、種子敗育和個(gè)體數(shù)量稀少而瀕臨滅絕［4-7］。目前紅欖李已被列為國家二級保護(hù)植物，在世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）紅色名錄中被列為受威脅物種［8］。2006—2018年該物種的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特征被相繼報(bào)道［4-7,9］，但相關(guān)研究中對紅欖李種子敗育的分子機(jī)制仍未知。

【前人研究進(jìn)展】質(zhì)譜定量分析方法已經(jīng)成為植物蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)重要工具。同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)在植物蛋白組學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛［10］。iTRAQ技術(shù)已應(yīng)用在植物根、葉、花藥、殼和芽等各組織蛋白質(zhì)組的鑒定中［10-12］。此外，植物對鹽脅迫、干旱脅迫、滲透壓、熱、鋁、汞和煙草花葉病毒（TMV）［12-15］等環(huán)境脅迫的響應(yīng)也已使用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行分析。應(yīng)用iTRAQ技術(shù)已鑒定出陸地棉［13］、小麥［16］、番茄［17］和葡萄［18］等胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)蛋白?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】瀕危植物紅欖李是國家二級保護(hù)植物，種子敗育是影響其瀕危的一個(gè)重要因素。本研究通過iTRAQ技術(shù)初步分析其種子敗育的分子機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問題】借助iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析紅欖李不同育性種子蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異。對質(zhì)檢合格的兩個(gè)蛋白質(zhì)組進(jìn)行酶解，iTRAQ標(biāo)記后進(jìn)行高效液相色譜、質(zhì)譜檢測；利用Mascot軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，通過iTRAQ定量尋找差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)行GO功能注釋、KEGG代謝通路和蛋白互作分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對候選差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，以期探討紅欖李種子敗育過程的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

收集紅欖李花瓣完全脫落后的種子?？捎N子采集于泰國東海岸（12°23′N，102°16′E）的Lam Ri-ngun和Chanthaburi，敗育種子采集于海南省三亞市鐵爐港紅樹林保護(hù)區(qū)（18°15′N，109°42′E）。刀剖種子檢測胚是否發(fā)育。

1.2 蛋白質(zhì)提取與定量

采用Kambiranda等［18］的方法提取紅欖李幼嫩種子的蛋白質(zhì)，采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒（Thermoffisher Scientific, UN, China）對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析（具體操作見說明書），最后將定量好的蛋白質(zhì)保存在-80℃冰箱中備用。

1.3 iTRAQ標(biāo)記與SCX分餾

取100 μg總蛋白，加入Trypisn Gold溶液（樣品∶試劑＝30∶1），37 ℃消化16 h，真空離心干燥獲得肽段干粉。用0.5 mol/L的TEAB復(fù)溶肽段，然后按照iTRAQ Reagen t8-plex試劑盒（SCIEX,Madison, WI, USA）進(jìn)行標(biāo)記（具體操作見說明書）。使用LC-20AB HPLC（Shimadzu, Kyoto, Japan）高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行SCX色譜分析（具體操作見說明書）。

1.4 基于QEXACTIVE的LC-ESI-MS/MS分析

采用LC-20AD納米高效HPLC液相系統(tǒng)（Shimadzu, Kyoto, Japan），根據(jù)說明書用緩沖液A懸浮肽段，終濃度約為0.5 μg/μL。用自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)吸入10 μL上清液，置于2 cm的C18捕集柱上，然后洗脫入10 cm 的C18分析柱（內(nèi)徑75 μm）上。將樣品以8 μL/min的速度加載4 min，然后使用濃度梯度2%～35%的緩沖液B（98% ACN，0.1% FA）以300 nL/min的流速運(yùn)行44 min；接著在2 min內(nèi)使緩沖液B濃度上升至80%，保持4 min；最后在1 min內(nèi)使緩沖液B濃度降到5%。將肽段通過納米液相色譜系統(tǒng)（HPLC）分離，該系統(tǒng)直接與Q-EXACTIVE質(zhì) 譜 儀（MS，ThermoFisher Scientific, San Jose,CA）連接，分離的樣品進(jìn)入Q-EXACTIVE質(zhì)譜儀分析。MS掃描，一級MS全掃描的m/z范圍為350～2 000 u，二級MS全掃描的m/z范圍為100～1 800 u。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用 Proteome Discoverer 1.2（PD 1.2，Thermo）軟件和5600 MS轉(zhuǎn)換器將從Orbitrap獲得的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成MGF文件。蛋白質(zhì)的鑒定使用Mascot軟 件（Version 2.3.02, Matrix Science Inc.,MA, USA），選擇已經(jīng)建立好的紅欖李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（NCBI登錄號：SRP127706）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。蛋白質(zhì)鑒定，完整肽段匹配誤差控制在20 mg/L以內(nèi)，片段匹配誤差控制在0.02 u以內(nèi)，胰蛋白酶消化最多允許1個(gè)發(fā)生錯(cuò)位。為了減少肽段鑒定的假陽性，待鑒定蛋白須符合Mascot概率分析軟件鑒定多肽的置信區(qū)間為99%以上，且在置信區(qū)間內(nèi)顯著性得分≥20。每個(gè)可信的鑒定蛋白都至少含有1個(gè)unique肽段。

1.6 生物信息學(xué)分析

在蛋白質(zhì)定量過程中，要求每個(gè)蛋白至少包含2個(gè)unique肽段。使用Mascot軟件中位數(shù)比值對蛋白質(zhì)的量進(jìn)行測定和標(biāo)準(zhǔn)化。當(dāng)P＜0.05且差異倍數(shù)＞1.5時(shí)認(rèn)為該蛋白差異顯著。

利用Gene Ontology（GO）軟件將差異表達(dá)蛋白與GO-Annotation@EBI網(wǎng)站下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析。為明確差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能特性，采 用 COG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/） 和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異蛋白分析。蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)分析使用STRING軟件［19］。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為驗(yàn)證iTRAQ結(jié)果，根據(jù)姚嘉龍等［20］的方法選擇8個(gè)候選基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)組鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。使用Primer Express軟件（Applied Biosystems）引物設(shè)計(jì)，引物序列見表1。以基因ubiquitin為內(nèi)參，基因相對表達(dá)量的計(jì)算公式為F=2-ΔΔCt。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

以紅欖李可育種子和敗育種子建立蛋白質(zhì)組，通過iTRAQ技術(shù)檢測共得到206 580個(gè)質(zhì)譜，通過Mascot 軟件分析，33 481個(gè)質(zhì)譜匹配到已知質(zhì)譜，30 435個(gè)質(zhì)譜與獨(dú)特的肽相匹配。另鑒定出6 138個(gè)已知肽段、5 769個(gè)unique肽和2 380個(gè)蛋白。肽段的數(shù)量分布如圖1所示，其中至少包含2個(gè)unique肽段的蛋白質(zhì)占比47%以上。而大于4肽的蛋白數(shù)量占比12.52%。

圖1 蛋白數(shù)量分布Fig. 1 Distribution of protein number

2.2 不同育性種子差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)過程及生物學(xué)功能特性分析

在敗育種子中共鑒定出448個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白238個(gè)（53%）、下調(diào)蛋白210個(gè)（47%）。根據(jù)生物學(xué)過程進(jìn)行分類，其中1.86%的蛋白與生殖相關(guān)，16.45%的蛋白參與代謝過程，15.78%的蛋白參與細(xì)胞過程，還有10.74%的蛋白被分類為單一生物過程蛋白（表2）。生物學(xué)功能特性分析結(jié)果表明，大多數(shù)蛋白都參與RNA加工和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)更新和蛋白伴侶等過程（圖2）。

表1 候選基因qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences for the candidate proteins

2.3 不同育性種子差異表達(dá)蛋白GO分析

GO分析結(jié)果表明，大多數(shù)差異表達(dá)蛋白主要參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的加工、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA降解、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的SNARE相互作用、植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及mRNA的監(jiān)測等生物學(xué)途徑（表3）。圖3所示蛋白相互關(guān)系，參照表3中蛋白號得出，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)差異蛋白中的sec13同源蛋白、熱休克蛋白（Hsp70）、DNA修復(fù)蛋白（RAD23-3）、核轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白和去泛素保護(hù)蛋白（dph1）下調(diào)，而UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素上調(diào)；與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白伸長因子-1-α、真核生物翻譯起始因子3亞基B和C、小泛素相關(guān)修飾因子2、聚腺苷酸結(jié)合蛋白2和4、依賴ATP的DEAD-盒子RNA解旋酶38以及程序性細(xì)胞死亡蛋白4均為上調(diào)表達(dá)，而真核翻譯起始因子3亞基f（elF3f）和RAN GTPase激活蛋白2在紅欖李敗育種子中出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；與RNA降解相關(guān)差異表達(dá)蛋白中，只有Hsp70和烯醇化酶2表現(xiàn)為下調(diào)，其余蛋白如熱休克結(jié)合蛋白1、U6 snRNA相關(guān)Sm類蛋白LSm5和多聚腺苷酸結(jié)合蛋白2和4均為上調(diào)；與SNARE相互作用相關(guān)差異表達(dá)蛋白Syntaxin-132結(jié)合121和52上調(diào)，而Syntaxin-23和24下調(diào)；葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶3是唯一的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的上調(diào)蛋白；紅欖李敗育種子中與mRNA監(jiān)測相關(guān)的差異表達(dá)蛋白多聚腺苷酸結(jié)合蛋白表達(dá)量上調(diào)。

表2 不同育性種子差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)過程分析Table 2 Biological process of the differentially expressed proteins of different fertility seeds

圖2 不同育性種子差異表達(dá)蛋白的功能分類Fig. 2 Functional classification of the differentially expressed proteins in different fertility seeds

表3 敗育紅欖李種子中差異表達(dá)蛋白的GO分析Table 3 Differentially expressed proteins in abortive L. littorea seeds by GO analysis

2.4 不同育性種子差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

圖3 敗育種子中差異表達(dá)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Protein interaction network of the differentially expressed proteins in abortive seeds

為了驗(yàn)證iTRAQ分析的結(jié)果，在GO分析的基礎(chǔ)上從差異表達(dá)蛋白中篩選出8個(gè)候選基因進(jìn)行qRT-PCR檢測，從轉(zhuǎn)錄表達(dá)層面上對蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。其中4個(gè)基因RAD23、protein714、Syntaxin-121、依賴ATP的DEAD-盒子RNA解旋酶基因在敗育種子中上調(diào)表達(dá)，而另外4個(gè)基因17.9 ku的Ⅱ類熱休克蛋白基因、去泛素保護(hù)蛋白dph1基因、葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶基因、羧酸酯酶基因則下調(diào)表達(dá)（圖4）。在這8個(gè)差異基因中除了RAD23外其他7個(gè)基因的表達(dá)量與蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果一致。

3 討論

在我國，瀕危紅樹植物紅欖李存在嚴(yán)重的有性生殖障礙，表現(xiàn)為種子敗育率高，在沒有人工輔助育種的情況下種子萌發(fā)率幾乎為零［6,8］，存在大量空胚現(xiàn)象［5,8］。但通過人工輔助育種等技術(shù)手段可實(shí)現(xiàn)紅欖李種子的萌發(fā)和幼苗撫育［4］。本研究利用iTRAQ的方法分析了紅欖李敗育種子和可育種子的蛋白組學(xué)差異情況，旨在揭示我國紅欖李種子發(fā)育過程中種子敗育的分子機(jī)制。在448個(gè)差異表達(dá)蛋白中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA降解、SNARE在囊泡運(yùn)輸中的相互作用、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和mRNA監(jiān)測等7類植物生理生化過程的蛋白都表現(xiàn)出不同的表達(dá)量。前人研究發(fā)現(xiàn)，這些相關(guān)蛋白均不同程度參與陸地棉［13］、小麥［14］、金魚草［21］、番茄［22］、大豆［23］、擬南芥［24］、玉米［25］等眾多植物的胚胎發(fā)育過程，且不同程度調(diào)控植物的育性。這些差異蛋白的揭示為研究紅欖李種子敗育機(jī)制和采用基因工程手段進(jìn)行深入研究提供了研究基礎(chǔ)。

3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白

在敗育紅欖李種子中有11種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工相關(guān)蛋白差異表達(dá)，其中sec13同源蛋白、DNA修復(fù)蛋白（RAD23-3）表達(dá)下調(diào)。在擬南芥中，sec13同源蛋白1通過控制AtDRP2A的膜結(jié)合在液泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用［26］。在金魚草花發(fā)育過程中，RAD蛋白通過抑制DIV蛋白的表達(dá)抑制花的發(fā)育［21］，而花的發(fā)育狀態(tài)直接影響種子的發(fā)育進(jìn)程。在番茄果實(shí)發(fā)育過程中，類RAD蛋白的功能非常保守，但其表達(dá)卻由環(huán)境和分子結(jié)合伴侶共同決定［22］。前期研究表明，參與淀粉代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)會(huì)調(diào)控大豆雄性不育性狀［23］。本研究中紅欖李敗育種子的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)。植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)素對植物蛋白分泌代謝起重要作用，對植物組織的生長起促進(jìn)作用［27］，該類蛋白在紅欖李敗育種子的蛋白質(zhì)組中表現(xiàn)為上調(diào)。

3.2 RNA轉(zhuǎn)運(yùn)

圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig. 4 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

植物延長因子參與細(xì)胞周期進(jìn)程和部分細(xì)胞延長過程中蛋白質(zhì)的合成。本研究在敗育種子差異表達(dá)蛋白中發(fā)現(xiàn)了一種參與RNA翻譯過程的因子即延長因子-1-α，以及其他7種蛋白，包括真核生物翻譯起始因子3亞基B和C、小泛素相關(guān)修飾因子2、聚腺苷酸結(jié)合蛋白2和4、依賴ATP的DEAD-盒子RNA解旋酶38以及程序性細(xì)胞死亡蛋白4，均為上調(diào)表達(dá)。已有研究表明，翻譯起始因子可控制擬南芥熱響應(yīng)性生長的翻譯終止和終止密碼子的通讀［24］，同時(shí)也會(huì)影響植物幼苗mRNA的選擇性翻譯［28］。RNA解旋酶是一種依賴NTP水解釋放能量來解旋雙鏈RNA分子的酶。RNA解旋酶與RNA分子所有活動(dòng)過程相關(guān)，包括核轉(zhuǎn)錄、剪切、核糖體生物合成、RNA輸出和細(xì)胞器的基因表達(dá)，廣泛參與植物的生長發(fā)育和脅迫反應(yīng)［25］。另外3種RNA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白SEC13同源蛋白OS、真核翻譯起始因子3亞基f（elF3f）和RAN GTPase激活蛋白2在紅欖李敗育種子中出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。elF3f蛋白表達(dá)與植物的小配子發(fā)生有關(guān)，從而影響花粉育性和種子發(fā)育情況［29］。RAN類蛋白是ras超家族中一種保守的小信號GTPase，參與RNAs和蛋白質(zhì)的核質(zhì)運(yùn)輸［30］。同時(shí)也參與有絲分裂過程，包括DNA的合成調(diào)控，紡錘體組裝，中心體復(fù)制，染色體排列、分離和解聚和核膜形成等［31］。在馬鈴薯中，RAN GTPase激活蛋白2在其免疫防護(hù)中發(fā)揮重要作用［32］。

3.3 RNA降解

在RNA降解相關(guān)蛋白中，熱休克蛋白（HSP）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、抗壞血酸過氧化物酶和銅/鋅超氧化物歧化酶均積極參與植物胚胎發(fā)育過程且發(fā)揮重要作用［26,31-32］。本研究鑒定出了一些小分子量的熱休克蛋白，如22 ku的Ⅱ類和17.9 ku的I類熱休克蛋白，這些小分子量的熱休克蛋白參與大豆的胚胎發(fā)育過程［33］。由蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖可見，HSP蛋白表現(xiàn)上調(diào)，而UGGT蛋白表現(xiàn)下調(diào)，這兩種蛋白質(zhì)協(xié)同作用，可能在紅欖李敗育種子的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

3.4 囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用

在植物細(xì)胞中SNAER介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸將細(xì)胞壁和膜上的物質(zhì)傳遞到細(xì)胞表面，在細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、擴(kuò)張和生長中發(fā)揮重要作用［34］。SNAER蛋白參與植物對細(xì)菌的抗性和病理相關(guān)蛋白的分泌［35］，能夠增強(qiáng)植物對干旱和病原體的抗性［36］。前期研究表明，紅欖李敗育種子受病害和蟲害的比例極高［4-6］。本研究參與到囊泡運(yùn)輸中的SNARE相互作用的差異表達(dá)是否為紅欖李種子發(fā)育過程中對病害和蟲害的應(yīng)急響應(yīng)仍需要持續(xù)驗(yàn)證。

3.5 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

在屬于植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白中，內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶廣泛分布在細(xì)菌、真菌和高等植物中，可以水解多糖的特定糖苷鍵（β-1,3-葡聚糖殘基鍵）。在紅欖李敗育種子中葡聚糖內(nèi)切-1,3-β-葡萄糖苷酶3是唯一與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的上調(diào)蛋白。內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶常在整個(gè)植物體內(nèi)表達(dá)，在小花、葉鞘和葉片中高度表達(dá)，它也是水稻花粉發(fā)育過程中胼胝質(zhì)降解所必需的［37］。在敗育紅欖李種子中，兩個(gè)與病理相關(guān)蛋白表現(xiàn)下調(diào)，這兩個(gè)蛋白是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白中較為重要的蛋白，受到生物和非生物脅迫誘導(dǎo)［38］。

3.6 mRNA監(jiān)測途徑

本研究發(fā)現(xiàn)在mRNA監(jiān)測途徑中的差異蛋白有3個(gè)，其中2個(gè)功能未知，1 個(gè)為聚腺苷酸結(jié)合蛋白。通過蛋白質(zhì)組表達(dá)譜比較分析發(fā)現(xiàn)，多聚腺苷酸結(jié)合蛋白與水稻溫敏性雄性不育相關(guān)［39］。酵母多聚腺苷酸結(jié)合蛋白基因（PAB1）在植物中表達(dá)時(shí)可作為一種致病模擬基因［40］。在紅欖李敗育種子中多聚腺苷酸結(jié)合蛋白表達(dá)量上調(diào)。葡萄糖和植物激素（如ABA、GA和乙烯）協(xié)同調(diào)控植物種子的萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育。真核生物釋放因子1-2（在半不育種子中表達(dá)量下調(diào)）影響擬南芥種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育過程中對葡萄糖和植物激素的響應(yīng)［41］。

4 結(jié)論

本研究借助iTRAQ技術(shù)對紅欖李不同育性種子的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異進(jìn)行分析，經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA降解、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的SNARE相互作用、植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和mRNA監(jiān)測途徑。而許多研究都證明這些差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子大多與花粉和種子發(fā)育、種子萌發(fā)、幼苗早期發(fā)育、環(huán)境脅迫和抗病性有關(guān)。在GO分析的基礎(chǔ)上篩選出8個(gè)候選基因進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示有7個(gè)基因的表達(dá)量與蛋白質(zhì)檢測結(jié)果一致，這從轉(zhuǎn)錄表達(dá)層面上對蛋白質(zhì)鑒定的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，從而肯定了蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果的正確性，為紅欖李敗育種子的分子機(jī)制深入研究奠定了基礎(chǔ)。