高 雪,尼瑪扎西,劉國一,譚海運(yùn)
(省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所,西藏 拉薩 850000)
【研究意義】近年來,水資源供需失衡是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)面臨的最嚴(yán)重問題之一,供水不足嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。植物對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制一直是遺傳育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。我國油菜種植面積和產(chǎn)量居世界首位[1],油菜種植區(qū)季節(jié)性干旱大面積頻發(fā),加之種植區(qū)內(nèi)全年降水量分布不均,對油菜種植過程造成巨大影響。干旱導(dǎo)致油菜無法正常播種、出苗慢、出苗不齊,甚至種植面積減少?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】根系是固定植物及吸收水分、運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官。對根系的研究及調(diào)查工作費(fèi)時費(fèi)工,而且田間調(diào)查取樣容易造成根系結(jié)構(gòu)破壞,這些增加了根系調(diào)查的難度。在長期研究及實(shí)際工作中,研究者及育種家更多關(guān)注植物地上部分對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng),對根系干旱響應(yīng)機(jī)制研究相對較少[2]。研究發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下玉米根重與產(chǎn)量呈正相關(guān),并檢測到與根系相關(guān)的16個QTLs位點(diǎn)與干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)[3]。不同耐旱性水稻在聚乙二醇6000(PEG6000)溶液處理后,對耐旱性強(qiáng)品種(系)根系特征方面的影響顯著小于抗旱性弱的品種(系)[4]。陳檢鋒等[5]研究認(rèn)為,玉米根系抗氧化能力的強(qiáng)弱可以區(qū)分抗旱級別。干旱脅迫對甘藍(lán)型油菜幼苗期根鮮重和側(cè)根數(shù)具有明顯抑制作用,主根長、側(cè)根數(shù)可作為甘藍(lán)型油菜早期初步抗旱性鑒定的重要輔助指標(biāo)[2]。不同生理期內(nèi),作物的生理反應(yīng)機(jī)制可用于篩選抗旱性品種(系)[6]。相對水分含量、脯氨酸、脅迫指數(shù)可作為小麥抗旱性強(qiáng)弱的鑒定指標(biāo)[7]。一定干旱脅迫程度下,甘藍(lán)型油菜葉片中葉綠素、類胡蘿卜素含量隨干旱程度加劇而降低,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、丙二醛含量及抗氧化酶系統(tǒng)活性則隨著干旱程度的加劇而升高[8]。萌發(fā)期采用10% PEG6000溶液脅迫處理,顯示抗旱指數(shù)、發(fā)芽率、根長、苗高和根體積等指標(biāo)可作為甘藍(lán)型油菜早期初步篩選抗旱性材料的鑒定指標(biāo)[9]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】西藏地區(qū)春油菜播種期干旱少雨,選育、篩選出抗旱性白菜型春油菜品種(系)能很好解決播種期干旱少雨的情況[10]。采用PEG6000溶液模擬干旱脅迫研究白菜型春油菜抗旱性的方法,重復(fù)性好、周期短、實(shí)驗(yàn)條件易于控制,可快速篩選抗旱性白菜型春油菜品種(系)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫,探索白菜型春油菜幼苗對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制,篩選適宜的PEG6000濃度及抗旱性白菜型春油菜品種(系),為西藏白菜型春油菜抗旱性育種奠定基礎(chǔ)。
124220-1、藏油3號、104005、093431等4個品種(系)白菜型春油菜種子由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院資源與環(huán)境研究所提供。
干旱脅迫參考米超等[11]方法進(jìn)行,發(fā)芽試驗(yàn)參考GB/T3543.4-1995。為保證試驗(yàn)一致性,分別隨機(jī)選取各品種(系)白菜型春油菜種子1 000粒,先用5% NaClO溶液消毒5 min,再用蒸餾水沖洗干凈,以三層濾紙為芽床,置于25℃自然光下萌發(fā),5 mL蒸餾水保濕。待種子露白,選取100粒正常發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)至PEG6000溶液為培養(yǎng)液(濃度分別為0%、5%、10%、15%、20%、25%)的培養(yǎng)皿(直徑12 cm,芽床由五層吸水紙及一層濾紙構(gòu)成)繼續(xù)培養(yǎng),進(jìn)行模擬干旱脅迫處理,以培養(yǎng)液為蒸餾水為對照,每個培養(yǎng)皿為1個重復(fù),共3個重復(fù)。培養(yǎng)箱設(shè)置條件:晝/夜溫度25℃/18℃,時長14h/10 h,光照條件為4 000 lx,脅迫處理時間為7 d。脅迫處理結(jié)束后統(tǒng)計(jì)白菜型春油菜幼苗存活數(shù),計(jì)算成苗率;隨機(jī)選取20株測定幼苗苗高、主根長、單株鮮重等形態(tài)指標(biāo),并計(jì)算相對活力指數(shù)、傷害率:
相對活力指數(shù)=處理成苗率×處理幼苗苗高;
取整株材料測定丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SPr)含量及超氧化物酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性,測定方法參照文獻(xiàn)[12],3次重復(fù)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。
不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫后各品種(系)白菜型春油菜的成苗率見表1。由表1可知,124220-1成苗率由96.02%下降至32.37%,傷害率由10.82%增加至66.29%;藏油3號成苗率由93.33%下降至32.33%,傷害率由7.56%增加至65.36%;104005成苗率由92.67%下降至32.37%,傷害率由7.92%增加至61.88%;093431成苗率由95.33%下降至25.58%,傷害率由16.33%增加至73.16%。隨干旱脅迫加劇,白菜型春油菜成苗率呈下降趨勢,傷害率呈增長趨勢,其中124220-1在每個處理梯度的傷害率均略大于其他品種,而104005均略低于其他3個品種。
從表1、表2可以看出,不同濃度PEG6000溶液脅迫后,各品種(系)白菜型春油菜平均苗高124220-1由45.33%降至14.98%,其中,藏油3號由29.43%降至10.11%,104005由31.39%降至9.02%,093431由27.57%降至11.26%;主根長124220-1由23.98%降至8.67%,藏油3號由25.3%降至11.23%,104005由19.33%降至10.62%,093431由24.33%降至12.58%;單株鮮重124220-1由60.25%降至25.25%,藏油3號由50.41%降至28.81%,104005由43.89%降至23.84%,093431由51.18%降至34.89%;相對活力指數(shù)124220-1由0.70降至0.11,藏油3號由0.70降至0.12,104005由0.73降至0.13,093431由0.69降至0.10。平均苗高、單株鮮重、主根長、相對活力指數(shù)均隨PEG6000溶液濃度增加而下降,幼苗各指標(biāo)(平均苗高、單株鮮重、主根長)傷害率亦同時增加。4個品種(系)白菜型春油菜各生長特性指標(biāo)傷害率大小不同,其中,124220-1各指標(biāo)略大于其他3個品種(系),為104005>093431>藏油3號>124220-1,抗旱性相對強(qiáng)弱排序亦如此。
以相對活力指數(shù)作為作物抗旱性鑒定指標(biāo)已用于實(shí)際工作[11-12],在15% PEG6000溶液濃度時,各品種(系)白菜型春油菜相對活力指數(shù)在50%~60%之間,成苗率分別為69.67%、68.67%、66.33%、59.67%,20%濃度成苗率分別為32.37%、32.33%、35.33%、25.58%??蓪?5%~20%濃度范圍作為白菜型春油菜模擬干旱脅迫的適宜濃度,對應(yīng)滲透壓約為-0.4MPa[13]。
從圖1可以看出,隨PEG6000溶液濃度升高,在5%~15%濃度范圍內(nèi),4種白菜型春油菜SOD、POD、CAT活性均呈升高趨勢。各溶液濃度脅迫下的白菜型春油菜SOD活性均大于對照,差異顯著。溶液濃度為15%~20%時,SOD活性不再升高,達(dá)到最大;濃度高于20%時,SOD活性呈下降趨勢,差異達(dá)到顯著性水平(圖1A)。104005在各溶液濃度脅迫下的SOD活性均高于其他3個品種(系),可見104005的抗旱性較強(qiáng)于其他3個品種(系)。不同PEG6000溶液濃度處理對白菜型春油菜的POD、CAT活性變化較大,均達(dá)到顯著性水平(圖1B、C),變化趨勢與SOD變化趨勢相似,且在一定溶液濃度范圍內(nèi),白菜型春油菜抗氧化系統(tǒng)酶活性變化與濃度呈正相關(guān)關(guān)系,可以區(qū)別不同品種(系)抗旱性強(qiáng)弱。
2.3.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對PEG脅迫的響應(yīng) 隨著PEG6000溶液濃度升高,4個品種(系)白菜型春油菜SPr含量變化均較大(圖2A),差異顯著。在0%~15%濃度范圍內(nèi),SPr含量隨濃度升高而增加,油菜細(xì)胞通過SPr含量升高調(diào)整滲透勢促進(jìn)吸水,維持細(xì)胞正常狀態(tài)。在20%濃度時SPr含量達(dá)到峰值,超過20%時,含量下降,差異達(dá)到顯著性水平,此時已超過白菜型春油菜細(xì)胞抵御干旱的耐受程度。其中,104005變化程度明顯高于其他3個品種(系),最大變化值為60 mg/g;124220-1變化相對最小、最大變化值為50 mg/g。
表1 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜幼苗成苗率、苗高及相對活力指數(shù)的影響Table 1 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling survival rate, seedling height and relative vigor index of spring rapeseed(B. campestris L.)
不同PEG6000溶液濃度(0%~20%)下,4個品種(系)白菜型春油菜Pro含量明顯升高(圖2B),達(dá)到顯著性水平。20%濃度時4個品種白菜型春油菜Pro含量變化最明顯,變化值最大,達(dá)到峰值;當(dāng)溶液濃度高于25%時,Pro含量下降明顯,達(dá)到顯著性水平,該干旱脅迫程度超過白菜型春油菜幼苗承受能力,使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞。其中,104005在各濃度處理中上升幅度最明顯,最大變化值達(dá)到50 μg/g。
隨著PEG6000溶液濃度升高,4個品種(系)白菜型春油菜SS含量呈上升趨勢,與濃度呈正相關(guān)關(guān)系,變化達(dá)到顯著性水平(圖2C)。同時細(xì)胞內(nèi)滲透勢調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加并積累,其中,104005在各濃度處理上變化最大,SS含量呈上升趨勢,最大變化值達(dá)到45 μg/g;124220-1變化趨勢與104005變化趨勢相似,變化值相對最小,最大變化值為36 μg/g。20%濃度處理時,不同品種(系)白菜型春油菜SS含量差異顯著,此濃度可作為白菜型春油菜抗旱性研究適宜的濃度水平,應(yīng)用于實(shí)際工作。
表2 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜幼苗主根長及單株鮮重的影響Table 2 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling main root length and fresh weight per plant of spring rapeseed(B. campestris L.)
圖1 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜抗氧化酶活性的影響Fig. 1 Effects of PEG6000 solution treatments on antioxidant enzyme activity of spring rapeseed(B. campestris L.)
2.3.2 MDA對PEG脅迫的響應(yīng) MDA是細(xì)胞質(zhì)膜過氧化產(chǎn)物,植物細(xì)胞遭受逆境脅迫時,其含量可反映膜系統(tǒng)過氧化損傷的程度。4個品種(系)白菜型春油菜MDA含量均隨PEG6000溶液濃度上升呈上升趨勢(圖2D),呈正相關(guān)關(guān)系,達(dá)到顯著性水平。124220-1在各濃度處理上變化最大,相較其他3個品種(系)對PEG6000溶液更敏感,而104005相對較遲鈍,變化值小于其他3個品種(系)。
遭受干旱脅迫時,作物根系首先作出響應(yīng),進(jìn)而影響作物的生長發(fā)育及形態(tài)建成[13],產(chǎn)量亦受到影響。根系是作物吸收水分、運(yùn)輸養(yǎng)分及物質(zhì)合成、同化、轉(zhuǎn)化的主要器官[4],研究作物根系與抗旱性的關(guān)系具有重要意義。作物遺傳育種領(lǐng)域以種子早期萌發(fā)指標(biāo)篩選抗旱材料的方法已得到廣泛應(yīng)用[14-18],根系的深度、根粗、根長、側(cè)根數(shù)等指標(biāo)與植物抗旱性強(qiáng)弱具有相關(guān)性,根系越發(fā)達(dá),植物抗旱性越強(qiáng)。本研究以PEG6000溶液模擬干旱脅迫,研究4個品種(系)白菜型春油菜芽期幼苗形態(tài)特征及生理生化的變化,結(jié)果表明,苗高、主根長、單株鮮重、相對活力指數(shù)等早期指標(biāo)隨PEG脅迫程度增強(qiáng)而加劇,其中強(qiáng)抗旱性品種(系)各指標(biāo)下降程度均小于抗旱性弱品種(系)。相對活力指數(shù)、苗高等指標(biāo)可作為衡量抗旱性強(qiáng)弱的重要指標(biāo),其他指標(biāo)可作為抗旱性篩選的輔助指標(biāo)[19],篩選出品系104005抗旱性強(qiáng)于其他3個品種(系)。
干旱脅迫時,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)最先反應(yīng),清除細(xì)胞內(nèi)由于干旱產(chǎn)生的大量過氧化自由基。植物體內(nèi)的活性氧自由基具有雙重性作用[20]。植物遭受外界干旱、寒冷等逆境脅迫時,細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)最先反應(yīng),能清除細(xì)胞內(nèi)由于外界脅迫產(chǎn)生的活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞免受活性氧自由基的氧化損傷,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基同時也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號物質(zhì),同時在脅迫信號傳遞過程中發(fā)揮重要作用,使植物對逆境脅迫做出響應(yīng)。逆境脅迫下,在植物細(xì)胞耐受范圍內(nèi),細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基可被抗氧化酶系統(tǒng)清除,超出這一范圍即細(xì)胞內(nèi)氧自由基積累到一定程度,抗氧化酶系統(tǒng)不能完全清除細(xì)胞內(nèi)過量的自由基,即會造成細(xì)胞氧化損傷,此時過量活性氧自由基亦可作為信號傳導(dǎo)物質(zhì)誘發(fā)植物體內(nèi)產(chǎn)生與抗旱相關(guān)蛋白質(zhì)及相關(guān)基因表達(dá),以抵御干旱逆境[21-23]。SPr、SS、Pro是植物體內(nèi)適應(yīng)干旱、寒冷、高溫、鹽漬等逆境脅迫過程中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),通過增加和積累含量提高細(xì)胞保水能力,對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起保護(hù)作用,使其能在外界處于干旱逆境中繼續(xù)吸水,以維持植物體細(xì)胞的正常形態(tài)及正常生長發(fā)育,增加植物干旱耐受力。細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)穩(wěn)定性是植物細(xì)胞正常生長發(fā)育的基礎(chǔ),逆境脅迫中植物細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性(通透性及流動性)是植物抵御逆境能力的體現(xiàn)。干旱、低溫等逆境脅迫破壞細(xì)胞質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)及功能,使植物細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換發(fā)生改變,其中細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲、胞外物質(zhì)自由進(jìn)出細(xì)胞是細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞的表現(xiàn),植物生長發(fā)育受到逆境影響。植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基主要攻擊膜系統(tǒng),膜系統(tǒng)損傷的主要產(chǎn)物是MDA。研究發(fā)現(xiàn),可以通過測定細(xì)胞MDA含量評價植物抵御逆境的能力[24]。本研究結(jié)果表明,隨著PEG脅迫濃度提高,MDA含量升高,細(xì)胞質(zhì)膜過氧化增強(qiáng),其中104005升高的程度最低,抗逆性強(qiáng)于其他3個品種(系)。
圖2 PEG6000溶液處理對白菜型春油菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及MDA含量變化Fig. 2 Effects of PEG6000 solution treatments on seedling osmoregulation and MDA content of spring rapeseed(B. campestris L.)
本研究以不同濃度PEG6000溶液模擬干旱脅迫,研究其對4個品種(系)白菜型春油菜芽期根系特征的影響,發(fā)現(xiàn)成苗率、主根長、苗高、單株鮮重隨溶液濃度升高逐漸下降,相對活力指數(shù)亦下降,其中,苗高及相對活力指數(shù)變異最大,各品種(系)變異系數(shù)均大于31%??寡趸富钚噪S溶液濃度呈先升高后降低趨勢,在15%濃度時活性最高,高于此濃度活性下降;SS、MDA含量隨PEG6000溶液濃度升高而增加,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SPr、Pro)呈先升后降趨勢。綜合相對活力指數(shù)及生理生化指標(biāo)可知,15%~20% PEG6000溶液濃度時,各品種(系)白菜型春油菜相對活力指數(shù)在50%~60%之間,也是抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn),可作為模擬水分脅迫抗旱性研究的最適濃度,并篩選到抗旱性白菜型春油菜品系104005。