劉 影，郭海勇，計銀鐸

(1.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海201699；2.吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平136000；3.明尼蘇達大學(xué) 雙城校區(qū)獸醫(yī)學(xué)院，美國 明尼蘇達州55108)

金黃色葡萄球菌是人和動物的一種重要致病菌，能引起各種感染，包括皮膚、軟組織感染及全身感染，也是引起牛、羊乳房炎的重要病原菌之一。金黃色葡萄球菌的致病性主要歸因于細菌產(chǎn)生的各種毒性因子，使細菌逃避機體的免疫系統(tǒng)而引發(fā)疾病[1-3]，而金黃色葡萄球菌的雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)saeRS是毒性因子的重要調(diào)節(jié)系統(tǒng)[4]，增強毒性因子hla(α毒素基因)、hlb(β溶血素基因)、hlgabc(γ溶血素基因)、lukED(殺白細胞素基因)和coa(血漿凝固酶基因)的轉(zhuǎn)錄和表達[5-7]。金黃色葡萄球菌毒素可損傷乳房上皮細胞[8]，促使牛、羊乳房炎發(fā)生。IL-17是一種刺激和介導(dǎo)機體產(chǎn)生炎性反應(yīng)的信號分子，誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生[9]、粒細胞生成和抵御細菌感染[10-12]，也是機體皮膚和粘膜抵御感染的免疫分子[13]。研究表明,IL-17在機體抵御金黃色葡萄球菌感染過程中起到關(guān)鍵性作用[14]。因此，試驗旨在利用金黃色葡萄球菌saeRS及其相關(guān)基因coa突變菌株研究saeRS和coa基因?qū)C體產(chǎn)生IL-17a的影響，探索金黃色葡萄球菌的致病機制，為臨床預(yù)防和治療牛、羊乳房炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試驗動物 金黃色葡萄球菌923(CA-MRSA)及其突變菌株923/coa、923/saeRS和923/coa/seaRS,各突變菌株特點如下：923/coa為敲除coa(血漿凝固酶)基因的菌株；923/saeRS為敲除saeRS(雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng))基因的菌株；923/coa/saeRS為敲除coa(凝血酶)和saeRS基因的菌株；Balb/c 雌性小鼠(上海吉輝試驗動物飼養(yǎng)有限公司)，體重15～18 g。

1.1.2 主要試劑 IL-17a ELISA 檢測試劑盒(Raybiotech)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)施設(shè)備 SPF動物房及隔離包(上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院SPF)，分光光度計(T-6 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠飼養(yǎng)管理 小鼠飼養(yǎng)于SPF實驗動物房，溫度為25 ℃，12 h光照，自由采食和飲水。購入小鼠4 d后開始動物試驗，試驗期間每天固定時間稱量體重，測量皮膚傷口面積，測量方法為：游標卡尺測量傷口的長度和寬度，長度乘以寬度計算出傷口面積。

1.2.2 細菌接種方法 細菌劃線接種于TSA平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單個菌落接種5 mL TSB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。翌日按1:100比例轉(zhuǎn)接至 TSB培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。吸取1 mL細菌懸液于離心管中，離心，去除上清液，加入1mL PBS，吸打混勻，離心，去上清。再用PBS洗2次。細菌懸液用PBS稀釋至107個/mL。小鼠隨機分組，每組10只小鼠，背部剃毛、消毒，每只小鼠背部皮內(nèi)注射100 μL細菌懸液。

1.2.3 血清制備和IL-17a檢測方法 每天測量小鼠體重及背部形成傷疤面積。分別于感染后8 h、24 h、72 h和120 h摘眼球法采血，制備血清。按照Raybiotech公司提供的IL-17a ELISA檢測方法檢測小鼠血清IL-17a。

1.2.4 皮膚內(nèi)細菌數(shù)測定 無菌條件下取細菌感染部位皮膚，稱重，勻漿，PBS稀釋104倍，涂布TSA平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日菌落計數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計方法 用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行單因方差分析和Duncan法進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 16.0 進行Pearson雙尾相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠體重

小鼠經(jīng)背部皮內(nèi)感染菌株923及其各突變菌株8 h、24 h、72 h和120 h后，各組體重如圖1所示。

感染細菌8 h后，923/coa/saeRS菌株感染組小鼠體重顯著高于923/coa菌株感染組小鼠體重(P<0.05)；感染細菌24 h和72 h后，923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組小鼠體重極顯著高于923/coa菌株感染組小鼠體重(P<0.01)；感染細菌120 h后，923/coa/saeRS菌株感染組小鼠體重極顯著高于923/saeRS菌株感染組小鼠體重(P<0.01)。

2.2 小鼠血清中IL-17a濃度

小鼠皮內(nèi)感染細菌后8 h、24 h、72 h及120 h小鼠血清IL-17a濃度見圖2。

小鼠皮內(nèi)細菌感染后，每個試驗組血清中IL-17a濃度逐漸升高，在24 h達到峰值，隨后濃度逐漸下降。感染后8 h，野生型菌株923組小鼠血清IL-17a濃度低于突變菌株923/saeRS組小鼠血清IL-

17a的濃度，其中菌株923組和923/saeRS組之間的IL-17a濃度差異達到統(tǒng)計學(xué)顯著(P<0.05)水平。感染后24～120 h，各試驗組間小鼠血清IL-17a濃度無顯著差異。

2.3 小鼠感染部位皮內(nèi)細菌數(shù)

小鼠背部皮內(nèi)感染菌株923及其各突變菌株72 h和120 h后，各組小鼠每克皮膚內(nèi)細菌數(shù)如圖3所示。

感染后72 h,923菌株感染組小鼠每克感染部位皮膚內(nèi)細菌數(shù)極顯著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組(P<0.01)。感染后120 h,923菌株感染組小鼠每克感染部位皮膚內(nèi)細菌數(shù)顯著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組(P<0.05)。

2.4 小鼠細菌感染部位傷疤面積

從圖4可以看出，感染后8 h，各組小鼠在感染部位均未產(chǎn)生可測量傷疤。感染后24 h野生型菌株923組小鼠的傷疤面積顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積(P<0.05)；感染后72 h和120 h，野生型菌株923和突變菌株923/coa組小鼠的傷疤面積極顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積(P<0.01)。

2.5 血清IL-17a濃度與傷口面積的相關(guān)系數(shù)

各時間點血清IL-17a濃度與傷口面積間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可以看出，感染后24 h血清IL-17a的濃度與感染后120 h小鼠感染部位傷疤面積的相關(guān)系數(shù)較強，并且達到極顯著水平(P<0.01)。

表1 血清IL-17a濃度與傷口面積的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient of IL-17a concentrationsand skin lesion size

3 討 論

3.1 小鼠體重

從試驗結(jié)果可以看出，突變菌株923/coa/saeRS感染組體重極顯著高于923/coa和923/saeRS菌株感染組，923/saeRS菌株感染組小鼠體重極顯著高于923/coa菌株感染組，說明突變菌株923/coa/saeRS的毒性低于923/coa和923/saeRS菌株，菌株923/saeRS的毒性低于923/coa菌株，這可能與saeRS基因控制較多毒性因子的表達有關(guān)[5-7]。

3.2 小鼠感染部位皮膚內(nèi)細菌數(shù)

感染細菌后的第3天和第5天，小鼠每克感染部位皮膚內(nèi)細菌數(shù)，923菌株感染組分別極顯著和顯著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染組，這可能是由于菌株923產(chǎn)生的毒性因子多于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株，造成菌株923逃避機體免疫系統(tǒng)的能力最強，而923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株毒性減弱[1-3]，因此923菌株在感染部位的細菌數(shù)最多，923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株在感染部位的細菌數(shù)減少。

3.3 小鼠血清中IL-17a濃度

感染后8 h，野生型菌株923組小鼠血清IL-17a濃度顯著低于突變菌株923/saeRS組，這可能與923菌株產(chǎn)生的血漿凝固酶引發(fā)感染部位產(chǎn)生凝血，抑制細菌向周圍擴散，從而降低感染初期血清IL-17a的濃度。

3.4 小鼠細菌感染部位傷疤面積

感染后8 h，各組小鼠在感染部位均未產(chǎn)生可測量傷疤。感染后24 h野生型菌株923組小鼠的傷疤面積顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積；感染后72 h和120 h，野生型菌株923和突變菌株923/coa組小鼠的傷疤面積極顯著高于突變菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的傷疤面積。上述試驗現(xiàn)象可能與923/saeRS和 923/coa/saeRS菌株的毒力較弱，產(chǎn)生的毒素減少，免疫細胞產(chǎn)生的IL-17a也較少，不能有效介導(dǎo)機體的炎性反應(yīng)，而很快被機體清除有關(guān)。突變菌株923/coa葡萄球菌血漿凝固酶直接受SaeRS調(diào)控[15]，野生型菌株923產(chǎn)生的血漿凝固酶，將無活性的凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘哪?，凝血后可以保護細菌不被免疫細胞吞噬，并形成免疫逃逸[1-16]，而且金黃色葡萄球菌還能產(chǎn)生抑制嗜中性粒細胞富集和吞噬功能的分子[2]，抑制炎性反應(yīng)，所以在感染部位形成的傷疤面積小于923/coa感染組，血清IL-17a的濃度也低于923/coa感染組。

3.5 血清IL-17a濃度與傷口面積的相關(guān)系數(shù)

感染后24 h血清IL-17a的濃度與感染后120 h小鼠感染部位傷疤面積呈較強的正相關(guān)，因此，感染后24 h血清IL-17a濃度可作為檢測和治療金黃色葡萄球菌感染的參考指標。

4 結(jié) 論

Coa和saeRS基因影響菌株923的毒性，從而影響被感染小鼠體重、感染部位細菌含量、感染部位皮膚傷疤面積和血清IL-17a濃度。