劉劍敏 董俊麗 唐靜宜 陳 凡

（武漢市第一醫(yī)院， 湖北武漢430022）

缺血性腦損傷致殘率和致死率高，是人類生命健康的重要威脅［1］；因此，開發(fā)治療腦缺血再灌注損傷的藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。大量研究結(jié)果表明，川芎嗪可保護(hù)線粒體［2］、促進(jìn)能量代謝［3］、清除氧自由基、抗炎［4］、抑制鈣超載、維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)［5?6］、抗細(xì)胞凋亡［7］等多方面抗心腦細(xì)胞缺血再灌注損傷及感染性腦水腫所致的腦組織損傷。同時(shí)，也有研究［8］表明川芎嗪對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用。川芎嗪對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制仍未明確。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞，通過(guò)氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD） 的方法離體模擬腦缺血再灌損傷，初步探討磷酸川芎嗪對(duì)HT22 細(xì)胞攝取葡萄糖能力及保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22 細(xì)胞（武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心）。

1.2 藥物與試劑 磷酸川芎嗪（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度為99.2%，批號(hào)100845?201702），臨用前用培養(yǎng)基配成相應(yīng)濃度，過(guò)濾除菌后備用；DMEM／F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國(guó)Gibco 公司）；CCK?8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；DMSO （美國(guó)Sigma 公司）；連二亞硫酸鈉（南京化學(xué)試劑一廠）；p?AMPK 抗體（Thr172，兔抗鼠一抗）、AMPK 抗體（美國(guó)Cell SignalingTechnology 公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。磷酸鹽緩沖液用前稀釋使用。

1.3 儀器 2306?2 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab 公司）；SW?CJ?2FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；BX?51 型倒置相差顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus 公司）；ELX8 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（德國(guó)Bioztek 儀器公司）；Western blot電泳裝置 （美國(guó)Bio?Rad 公司）；Western blot 轉(zhuǎn)膜裝置（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR 公司）。

2 方法

2.1 HT22 細(xì)胞培養(yǎng) HT22 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%滅活胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、平衡濕度、含5%CO2和95%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后傳代1～2 代進(jìn)行模型建立，以后每隔2 d 全量換液，或根據(jù)培養(yǎng)基顏色定期換液，直到相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2 造模與分組 當(dāng)HT22 細(xì)胞長(zhǎng)至近70% 時(shí)，用0.125%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)／mL，接種于24 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層厚進(jìn)行分組。因在缺血性腦損傷治療領(lǐng)域明確具有能量代謝機(jī)制的陽(yáng)性對(duì)照藥缺乏，故未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、磷酸川芎嗪（5、10、15 μg／mL） 組，每組6 孔，磷酸川芎嗪在OGD 前預(yù)處理24 h。上述各組孵育24 h 后，空白對(duì)照組各孔加入2 mL 高糖DMEM 培養(yǎng)基，OGD 模型組和磷酸川芎嗪預(yù)處理組各孔加入含連二亞硫酸鈉（2 mmol／L）的無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)（37 ℃，5% CO2、95%N2） 孵育4 h，最后復(fù)糖復(fù)氧24 h。以CCK?8 試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率＝（OD給藥組／OD空白對(duì)照組）×100%。

2.3 葡萄糖攝取能力檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［9?10］，測(cè)定磷酸川芎嗪對(duì)HT22 細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響。通過(guò)檢測(cè)2?脫氧葡萄糖熒光類似物（2? ［N? （7?nitrobenz ?2? oxa ?1，3 ?diaxol ?4?yl） amino］ ?2? deoxyglucose，2?NBDG） 的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)各組細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取活性。各組處理后的HT22 細(xì)胞，加入2?NBDG （100 μmol／L） 孵育30 min，以4 ℃PBS 清洗3 次，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為542 nm，通過(guò)熒光顯微鏡及全自動(dòng)酶標(biāo)儀探測(cè)各孔熒光強(qiáng)度，并通過(guò)熒光強(qiáng)度與每孔細(xì)胞的數(shù)量比值表示HT22 細(xì)胞葡萄糖攝取能力，最后結(jié)果以空白對(duì)照組為100% 進(jìn)行換算。

2.4 Western blot 法檢測(cè)HT22 細(xì)胞AMPK、p?AMPK 蛋白表達(dá) 收集各組實(shí)驗(yàn)處理后的HT22 細(xì)胞，以蛋白提取試劑盒進(jìn)行總蛋白提取，采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。采用SDS?PAGE 電泳，配制10%分離膠，5%濃縮膠，蛋白上樣量為30 μg，進(jìn)行電泳 （80 V，30 min；隨后110 V，60 min），切膠，轉(zhuǎn)膜（250 mA 恒流，90 min），室溫下5%脫脂奶粉封閉90 min，TBST 清洗后，加入一抗p?AMPK（1 ∶500）、AMPK （1 ∶500）、β?actin （1 ∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 清洗，加入二抗孵育（1 ∶2 000） 孵育1 h。TBST 清洗3 次，將ECL 發(fā)光液A、B 各500 μL 等量混合后，將NC 膜浸泡在混合液里，避光1 min，掃描儀掃描條帶，應(yīng)用Image J 軟件對(duì)蛋白信號(hào)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用Graph Pad Prim 6 軟件繪圖，數(shù)據(jù)以（） 表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 磷酸川芎嗪對(duì)HT22 細(xì)胞活性的影響 如圖1 所示，OGD 模型組HT22 細(xì)胞核固縮，胞體膨脹甚至破裂，細(xì)胞膜不完整，折光性差；隨著磷酸川芎嗪濃度的增加，HT22細(xì)胞胞體變得飽滿，邊緣逐漸光滑，且有較強(qiáng)折光性；從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上，磷酸川芎嗪對(duì)OGD 損傷HT22 細(xì)胞具有保護(hù)作用。如圖2 所示，與空白對(duì)照組比較，模型組HT22細(xì)胞存活率降低（P＜0.01），而磷酸川芎嗪預(yù)處理后，隨著濃度增加，細(xì)胞存活率呈升高趨勢(shì)，其中磷酸川芎（10、15 μg／mL） 存活率升高（P＜0.05，P＜0.01）。

3.2 磷酸川芎嗪對(duì)HT22 細(xì)胞2?NBDG 的攝取的影響 如圖3 所示，與空白對(duì)照組（100±0.26）%相比，經(jīng)OGD 處理后HT22 細(xì)胞對(duì)2?NBDG 的攝取能力下降 ［（45.17±0.92）%，P＜0.01］；經(jīng)5 μg／mL 磷酸川芎嗪預(yù)處理后，細(xì)胞對(duì)2?NBDG 的攝取能力增加到（75.37±2.08）%；與模型組比較，15 μg／mL 磷酸川芎嗪預(yù)處理下的HT22 細(xì)胞對(duì)2?NBDG 的攝取能力增加到［（108.00±3.02）%，P＜0.01］。糖氧剝奪造成HT22 細(xì)胞活性下降，對(duì)2?NBDG 的攝取能力顯著下降；磷酸川芎嗪預(yù)處理可提高HT22 細(xì)胞對(duì)2?NBDG的攝取能力。

圖1 各組HT22 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化（標(biāo)尺＝50 μm）

圖2 磷酸川芎嗪對(duì)HT22 細(xì)胞存活率的影響（n＝3）

圖3 磷酸川芎嗪對(duì)HT22 細(xì)胞2?NBDG 攝取的影響（n＝3）

3.3 磷酸川芎嗪對(duì)糖氧剝奪下HT22 細(xì)胞p?AMPK 蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與空白對(duì)照組比較，OGD 并不改變HT22 細(xì)胞中AMPK 表達(dá)，磷酸川芎嗪預(yù)處理也不改變HT22 細(xì)胞中AMPK 表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，OGD 上調(diào)HT22 細(xì)胞中p?AMPK 的表達(dá)（P＜0.05）；同時(shí)，HT22 細(xì)胞p?AMPK 隨著磷酸川芎嗪濃度的增加而增加，其中15 μg／mL 磷酸川芎嗪組p?AMPK 增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OGD 能促進(jìn)HT22 細(xì)胞p?AMPK的表達(dá)，同時(shí)，磷酸川芎嗪預(yù)處理明顯激活A(yù)MPK 而上調(diào)p?AMPK 的蛋白表達(dá)。

圖4 各組細(xì)胞p?AMPK、AMPK 蛋白表達(dá)（n＝3）

4 討論

缺血性腦損傷有很高的致殘率和致死率，是威脅人類生命健康的一個(gè)重要原因，因此，其預(yù)防和治療非常重要。短時(shí)氧糖剝奪可模擬在某些疾病狀態(tài)下（如腦卒中） 引起的氧糖供應(yīng)缺乏，延時(shí)再灌則反映氧糖供應(yīng)缺乏的基礎(chǔ)上恢復(fù)氧糖供應(yīng)后細(xì)胞的損傷狀況，即氧糖剝奪再灌注可模擬機(jī)體的缺血?再灌注損傷。本研究采用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22 細(xì)胞，是為了更好的模擬缺血?再灌注損傷時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元的活性變化。

2?脫氧葡萄糖（2?DG） 為天然D 型葡萄糖衍生物，其2 位氧可被熒光基團(tuán)NBD 取代，成為熒光標(biāo)記的2?NBDG。它與2?DG 類似，都可通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1 識(shí)別轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)［9］。2?NBDG 常被用作細(xì)胞葡萄糖攝取的敏感探針，細(xì)胞攝取2?NBDG 后熒光強(qiáng)度的變化可以通過(guò)熒光酶標(biāo)儀、激光共聚焦掃描成像和流式細(xì)胞儀等技術(shù)檢測(cè)，其中以熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)法更簡(jiǎn)單快速易行［10］。本研究發(fā)現(xiàn)在OGD 發(fā)生后，HT22 細(xì)胞活性下降，對(duì)2?NBDG 的攝取能力大大下降；在磷酸川芎嗪預(yù)處理下，HT22 細(xì)胞對(duì)2?NBDG的攝取能力隨著磷酸川芎嗪濃度的增加而逐漸增加，這提示磷酸川芎嗪對(duì)神經(jīng)元缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，可能與細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取有關(guān)。

研究者發(fā)現(xiàn)AMPK 通過(guò)增加在胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)以及糖酵解，維持AMP 與ATP 穩(wěn)態(tài)，而使得細(xì)胞生存［11?12］。本研究中無(wú)論是OGD 處理，還是磷酸川芎嗪預(yù)處理均不改變HT22 細(xì)胞中AMPK 的表達(dá)；然而，OGD 可以激活HT22細(xì)胞AMPK，上調(diào)p?AMPK 表達(dá)。AMPK 作為細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，正常生理?xiàng)l件下無(wú)活性，任何導(dǎo)致AMP／ATP 升高的因素（如缺血缺氧、氧化應(yīng)激等），均會(huì)激活A(yù)MPK［13］。本研究中隨著磷酸川芎嗪濃度的增加，HT22 細(xì)胞對(duì)2?NBDG 攝取能力的增加，是否與p?AMPK 表達(dá)上調(diào)存在一定關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步研究。磷酸川芎嗪有可能通過(guò)激活A(yù)MPK，增加在胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。p?AMPK 參與產(chǎn)能反應(yīng)，促進(jìn)葡萄糖攝取、糖酵解等，使得ATP 產(chǎn)生增加，同時(shí)抑制蛋白質(zhì)合成等耗能反應(yīng)，減少ATP 消耗［14］。在短期能量缺乏下，p?AMPK 通過(guò)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增加糖酵解［15］。也有研究表明長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度激活A(yù)MPK 會(huì)加重腦組織損傷，Compound C （AMPK 抑制劑） 具有神經(jīng)保護(hù)作用［16］。產(chǎn)生以上不一致結(jié)果的原因可能與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、模型制作等差異有關(guān)［17］。如何在合適的時(shí)間給予合適強(qiáng)度的激活A(yù)MPK 干預(yù)，可能是實(shí)現(xiàn)腦缺血保護(hù)的關(guān)鍵。

綜上所述，在HT22 細(xì)胞氧糖剝奪損傷模型中，磷酸川芎嗪預(yù)處理可上調(diào)p?AMPK 表達(dá)，增加HT22 細(xì)胞的對(duì)葡萄糖的攝取，維持了胞內(nèi)的能量平衡，從而發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。