應(yīng)偉，王興遠(yuǎn)，江波，周偉

廣安市人民醫(yī)院（四川大學(xué)華西廣安醫(yī)院）腫瘤科，四川 廣安 638000

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率均較高，發(fā)病率居惡性腫瘤第五位，病死率居惡性腫瘤第三位[1]。迄今為止，胃癌在中國、日本仍很普遍，但目前對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的了解仍甚少[2]。證據(jù)顯示遺傳和環(huán)境因素與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，胃癌的發(fā)展是多種因素共同作用的結(jié)果，包含了多種表觀遺傳的改變[3-4]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長度約在200個(gè)核苷酸以上，被定義為在基因組中普遍轉(zhuǎn)錄的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物[5]。其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過與染色質(zhì)的修飾復(fù)合物結(jié)合，順式和反式特異性沉默基因組位點(diǎn)，并參與細(xì)胞生長、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移[5-6]。H19是染色體11p15.5上的一個(gè)母系表達(dá)的印跡基因，編碼一個(gè)帶帽和剪接的RNA，并與癌癥有關(guān)[7]。它是人類基因組中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)lncRNA，在哺乳動(dòng)物的發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[8-11]。lncRNA的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）可影響基因表達(dá)和功能，并與人類多種疾病的易感性相關(guān)。因此，本研究擬通過對(duì)H19rs217727基因位點(diǎn)的SNP進(jìn)行分析，研究其與胃癌之間的關(guān)聯(lián)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3月至2018年3月廣安市人民醫(yī)院收治的胃癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢查確診為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：有血液性或其他自身免疫性疾病和腫瘤病史；既往接受過放化療。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入128例胃癌患者，設(shè)為病例組，均抽取靜脈血約5 ml。另選取廣安市人民醫(yī)院同期健康體檢者130例為對(duì)照組。兩組研究對(duì)象性別、年齡等臨床特征比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。

表1 對(duì)照組與病例組研究對(duì)象的臨床特征

1.2 主要試劑與儀器

lncRNA H19引物、2×Taq聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix均購自Qiagen生物科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)酶試劑盒購自英國RNADOX公司，Gold ViewⅠ型核酸染色劑購自上海拜力生物科技有限公司，RsrⅡ限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司，核酸提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。ChemiDoc XRC凝膠電泳成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，DYY-6C型電泳儀購自北京六一公司，2-16K臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自德國Sigma公司，PTC200多通道PCR擴(kuò)增儀購自美國MJ公司。

1.3 標(biāo)本采集

采用真空抗凝管采集空腹靜脈血5 ml，3000 r/min離心10 min，放于-80℃冷凍貯存、待檢。

1.4 DNA 提取及基因分型

采用酚-氯仿抽提法提取DNA，通過Nanodrop檢測(cè)濃度后進(jìn)行SNP分型，用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)研究對(duì)象中l(wèi)ncRNA H19的基因多態(tài)性，rs217727 C＞T基因引物：正義，5'-ACTCAGGAATCGGCTCTGGAAGGTG-3'；反 義 ，5'-GATGTGGTGGCTGGTGGTCAACGGT-3'。PCR 反應(yīng)體系 15 μl，含模板 DNA 1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，2×Taq PCR Master Mix 7 μl，去離子水 5 μl。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，63 ℃ 45 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物分別用RsrⅡ酶、37℃恒溫水浴箱進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠100 V電泳40 min，溴化乙啶染色分析酶切結(jié)果?；蛐偷呐凶x由2名研究人員進(jìn)行，若出現(xiàn)判讀不一致，則需重新檢測(cè)?；蚍中统晒β蔬_(dá)到100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，單因素及多因素分析采用Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

lncRNA H19 rs217727 C＞T被酶切為CC、CT、TT基因型，CC基因型顯示為226 bp+21 bp，CT基因型為247 bp+226 bp+21 bp兩條帶，TT基因型為247 bp+21 bp；3種基因型中21 bp條帶均不顯示。（圖1）

圖1 rs 217727多態(tài)位點(diǎn)酶切圖片

2.2 基因分型與測(cè)序

對(duì)照組中CC、CT、TT基因型分別為58例（44.6%）、58例（44.6%）、14例（10.8%），病例組中分別為 39例（30.5%）、63例（49.2%）、26例（20.3%）。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，其結(jié)果與PCR-RFLP分型結(jié)果一致（圖2～圖4）。Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)提示P＞0.05，對(duì)照組的基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。

圖2 lncRNAH19rs 217727CC基因型

圖3 lncRNAH19rs 217727CT基因型

圖4 lncRNAH19rs 217727TT基因型

2.3 lncRNAH19rs 217727C＞T 與胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

lncRNA H19 rs217727 C＞T在對(duì)照組與病例組中進(jìn)行不同基因模型下的Logistic回歸分析結(jié)果顯示，共顯性基因模型，TT基因型與CC基因型比較，TT基因型增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR=2.76，95% CI=1.28～5.94，P=0.009，校正混雜因素后OR=2.99，95% CI=1.37～6.56，P=0.006；顯性基因模型 ，rs217727 CT+TT基因型使胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加1.84倍，OR=1.84，95% CI=1.10～3.09，P=0.020，校正混雜因素后 OR=1.84，95% CI=1.10～3.09，P=0.020；隱性基因模型，TT基因型胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是CC+CT基因型的 2.11倍，OR=2.11，95% CI=1.05～4.26，P=0.037，校正混雜因素后 OR=2.34，95% CI=1.13～4.83，P=0.022。此外，等位基因模型中，T等位基因顯著增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR=1.65，95% CI=1.16～2.36，P=0.006。（表2）

表2 lncRNA H19 rs217727與胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.4 lncRNA H19rs 217727基因多態(tài)性與胃癌臨床特征的關(guān)系

在病例組中，按照胃癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組，采用Logistic回歸分析顯性基因模型、隱性基因模型與胃癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，lncRNA H19 rs217727與胃癌分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。（表3）

表3 lncRNA H19 rs217727基因多態(tài)性與胃癌臨床特征的關(guān)系

3 討論

H19基因長約2.3 kb，位于11p15.5，包含5個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子[12]。研究表明，lncRNA H19在腫瘤的發(fā)生、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[13]。其作為一個(gè)lncRNA，缺乏開放閱讀框翻譯蛋白質(zhì)，然而，其最終產(chǎn)物為RNA序列，并參與RNA的調(diào)節(jié)[14]。由于H19基因突變與癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的關(guān)系目前仍未明確，其基因多態(tài)性一直是近年來的研究熱點(diǎn)[15]。迄今為止，已有許多研究顯示H19單核苷酸多態(tài)性與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)后密切相關(guān)，如胰腺癌、乳腺癌、肝癌等[16-18]。然而，lncRNA H19 rs217727 C＞T基因多態(tài)性與胃癌的研究仍少有報(bào)道。

本研究通過對(duì)照研究旨在表明lncRNA H19 rs217727 C＞T基因多態(tài)位點(diǎn)與廣安地區(qū)人群胃癌遺傳易感性的關(guān)系，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)其基因型，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)TT基因型能使人群罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增大，校正混雜因素后OR=2.99，95% CI=1.37～6.56，P=0.006；通過合并雜合子與突變型純合子，組成顯性基因模型，等位基因模型中，T等位基因與C等位基因相比可顯著增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR=1.65，95% CI=1.16～2.36，P=0.006。TT基因型、T等位基因增加人群罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)，與Yang等[16]的研究結(jié)果一致。

SNP是最簡(jiǎn)單的DNA基因突變形式，它可以發(fā)生在群體內(nèi)的個(gè)體之間，并且可能影響啟動(dòng)子活性（基因表達(dá)）、mRNA構(gòu)象（穩(wěn)定性）和翻譯效率[19]。雖然lncRNA H19 rs217727 C＞T基因多態(tài)性不影響H19 mRNA的表達(dá)水平，但突變可能改變翻譯效率，可能導(dǎo)致H19結(jié)構(gòu)的改變，最終影響H19的功能。研究表明，H19對(duì)胃癌的作用是通過直接上調(diào)ISM1介導(dǎo)的，ISM1是H19的結(jié)合蛋白，H19結(jié)構(gòu)的改變可能影響H19與ISM1的結(jié)合[20]。然而，目前關(guān)于H19在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制仍尚不清楚。

本研究仍有局限性。首先，小樣本量可能無法檢測(cè)全面，人群基因受地域、環(huán)境、生活習(xí)慣等的影響可能表型不同，本研究樣本來源單一。其次，納入研究的對(duì)象無法避免選擇偏倚。然而，由于缺少臨床信息，如幽門螺桿菌感染的數(shù)據(jù)，使得沒有對(duì)此因素進(jìn)行分析。此外，由于吸煙、飲酒、個(gè)人生活習(xí)慣等數(shù)據(jù)是通過問卷收集的，仍可能存在偏倚。最后，本研究是基于廣安地區(qū)漢族人群SNP與胃癌的關(guān)系研究，在數(shù)據(jù)應(yīng)用上也謹(jǐn)慎民族、地域的差異?？傊?，本研究結(jié)果表明H19 SNP（rs217727 C＞T）與廣安地區(qū)漢族人群胃癌風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，未來仍需要多中心聯(lián)合、大樣本、分層研究更進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。