馬莉亞， 鄭海濱， 徐芳芳

1臨海市中醫(yī)院醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)共同體兒內(nèi)科(浙江臺(tái)州 317000)； 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(浙江臺(tái)州 317000)

哮喘(asthma，AS)是兒童最常見的慢性炎癥性呼吸道疾病，其在全球范圍流行仍在繼續(xù)，2014年波蘭的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)3歲以上兒童的哮喘患病率已經(jīng)高于成人(8.6%與5.4%)[1-2]。國內(nèi)兒童哮喘的發(fā)病情況同樣非常嚴(yán)峻，2010年溫州兒童哮喘的患病率為3.3%，較2000年升高了約2.5倍，2000—2014年遼西地區(qū)的另一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)0～14歲兒童的哮喘患病率也達(dá)2.50%，并且和國外相關(guān)報(bào)道類似，遼西地區(qū)相關(guān)資料的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兒童哮喘的發(fā)病存在遺傳傾向[3-5]。因此，從基因?qū)用嫣剿鲀和陌l(fā)病機(jī)制對(duì)兒童哮喘的防控具有重要意義。TIM(T cell immunoglobulin domain and mucin domain)基因家族在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，是哮喘發(fā)病相關(guān)基因研究的一個(gè)重要方向[6]。本研究選取TIM-4基因的rs6874202和rs62382402位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性測定，探討TIM-4基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和浙江臺(tái)州地區(qū)漢族兒童哮喘發(fā)病的可能遺傳關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)收集2017年8月至2018年9月臺(tái)州地區(qū)的無血緣關(guān)系的漢族哮喘組患兒169例，其中男89例，女80例，年齡2～13歲，平均(5.90±2.54)歲；哮喘患兒診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸內(nèi)科分會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，且無先天性心臟病、心功能不全及其他自身免疫疾病史。選取同期117例健康體檢兒童作為對(duì)照組，其中男53例，女64例，年齡2～14歲，平均(6.27±2.79)歲，均無呼吸系統(tǒng)變應(yīng)性疾病和自身免疫疾病史。兩組間年齡、性別均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶均購自上海捷瑞生物工程有限公司。PCR引物由上海捷瑞公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 全部研究對(duì)象均在就診當(dāng)天或入院第2天清晨空腹抽取靜脈血，以EDTA-Na2抗凝，保存于-86℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，用于基因組DNA抽提。

1.3.2TIM-4基因多態(tài)性檢測 (1)DNA提取 參考血液基因組DNA提取試劑盒法提取全血中DNA，使用核酸分析儀來測定DNA的濃度和A260/A280比值，將比值位于1.7～2.0之間者作為PCR擴(kuò)增模板。(2)PCR引物：上游引物：5′-ATGAACAGATAACCAGGGAT-3′，下游引物：5′-TTAGCATTTGATTGACCC-3′。PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5 μL，dNTP(各10 mmol/L) 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL(20 μmol/L)，DNA模板0.1 μg，Taq DNA聚合酶0.5 U，加雙蒸水至總體積25 μL。(3)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性45 s，54℃退火1 min 30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。(4)測序方法：反應(yīng)結(jié)束后，吸取擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL置于2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，然后采用凝膠成像分析PCR產(chǎn)物的特異度。特異度產(chǎn)物由上海桑尼生物工程有限公司采用ABI-3100測序儀進(jìn)行測序分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用在線SHEsis軟件在哮喘組和對(duì)照組中進(jìn)行兩個(gè)位點(diǎn)的Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)；采用PASW Statistics 18統(tǒng)計(jì)軟件，采用2檢驗(yàn)來比較研究對(duì)象之間的基因型表達(dá)頻率和等位基因頻率的差異，以比值比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)來表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組與對(duì)照組的TIM-4基因PCR擴(kuò)增片段的測序結(jié)果TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)測序可得CC、CT、TT三種基因型，TIM-4基因rs62382402位點(diǎn)基因型為CC和CT型。見圖1。

注：A中箭頭為rs6874202位點(diǎn)CC型；B中箭頭為rs6874202位點(diǎn)CT型；C中箭頭為rs6874202位點(diǎn)TT型；D中箭頭為rs62382402位點(diǎn)CC型；E中箭頭為rs62382402位點(diǎn)CT型

2.2 兩組間各基因型和等位基因頻率 哮喘組和對(duì)照組rs6874202位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(2=0.094和1.387，P>0.05)，表明研究對(duì)象具有群體代表性；哮喘組和對(duì)照組rs62382402位點(diǎn)的基因型分布也符合Hardy—Weinberg平衡檢驗(yàn)(2=1.078和1.674，P>0.05)，具有群體代表性。哮喘組和對(duì)照組之間rs6874202位點(diǎn)TT+CT基因型和T等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=5.348、4.129，P<0.05)，見表1。哮喘組和對(duì)照組之間rs62382402位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率差無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=2.072和1.873，P>0.05)。見表2。

表1 兩組間rs6874202位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表2 兩組間rs62382402位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

3 討論

哮喘是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞以及白細(xì)胞介素(IL)-33、IL-25、胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)等多種細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病[8]，經(jīng)典適應(yīng)性免疫途徑認(rèn)為Th1/Th2失衡所引發(fā)的免疫功能紊亂是其發(fā)病的一個(gè)重要因素。Th1輔助細(xì)胞不僅介導(dǎo)細(xì)胞免疫，同時(shí)也參與了炎癥反應(yīng)，它通過分泌γ干擾素(IFN-γ)、IL-2等多種細(xì)胞因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對(duì)哮喘有保護(hù)作用；而Th2細(xì)胞則參與B細(xì)胞的增殖，與抗體產(chǎn)生及速發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)，促進(jìn)了氣道炎癥的演變和哮喘的發(fā)病。編碼區(qū)位于人類染色體5q33.2區(qū)域的TIM基因家族包含有TIM-1、TIM-3、TIM-4三個(gè)成員，TIM基因家族編碼的T細(xì)胞表面分子蛋白參與了Th1和Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)，針對(duì)TIM-1基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)研究已經(jīng)提示其與哮喘的發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系[9-10]。

作為TIM-1的天然配體，TIM-4通過與TIM-1的交互作用參與并調(diào)節(jié)了Th2細(xì)胞的分化與增殖過程[6]，同時(shí)，具有高水平表達(dá)TIM-4的B細(xì)胞也能夠誘導(dǎo)初始的CD4+T細(xì)胞選擇性地向Th2細(xì)胞分化[11]。TIM-4也表達(dá)于成熟的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞的膜表面，研究提示，誘導(dǎo)過敏后的樹突狀細(xì)胞中TIM-4表達(dá)明顯增加，并進(jìn)一步促進(jìn)氣道過敏的發(fā)生[12-13]。因此，TIM-4基因的表達(dá)和一些自身免疫性疾病、過敏性疾病相關(guān)。有報(bào)道提示TIM-4基因的啟動(dòng)子多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病活動(dòng)性相關(guān)[14]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎小鼠中鼻組織中TIM-4表達(dá)增高，抑制TIM-4的表達(dá)可以改善過敏性鼻炎的病理變化[15]；亦有研究發(fā)現(xiàn)在被卵清蛋白及霍亂毒素致敏的慢性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜中檢測到高頻率的TIM-4+樹突狀細(xì)胞[16]。

針對(duì)TIM-4基因多態(tài)性和哮喘發(fā)病的關(guān)系國內(nèi)已有報(bào)道。如吳小慧等[17]發(fā)現(xiàn)中國湖北地區(qū)漢族支氣管哮喘人群中存在TIM-4基因外顯子2區(qū)Lys65Lys(G/A)的基因多態(tài)性；Zhao等[18]發(fā)現(xiàn)TIM-4基因rs6882076和rs4702747這兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性與山東省漢族人群的哮喘易感性相關(guān)；2012年中國西南地區(qū)的另一項(xiàng)研究則揭示TIM-4基因rs4704727多態(tài)性可能與兒童哮喘有關(guān)[19]。本研究提示TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)多態(tài)性與浙江臺(tái)州地區(qū)兒童的哮喘發(fā)病存在相關(guān)性，同時(shí)，未發(fā)現(xiàn)rs62382402位點(diǎn)多態(tài)性與浙江臺(tái)州地區(qū)兒童的哮喘發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。從基因型和等位基因頻率相關(guān)分析可以看到，TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)的(TT+CT)基因型兒童較CC基因型兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)高(OR=1.772，95%CI=1.089～2.883)，且哮喘組的T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(OR=1.510，95%CI=1.013～2.251)。因此，TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)多態(tài)性T等位基因可能是兒童哮喘的遺傳易患基因。目前，TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)多態(tài)性和哮喘之間關(guān)聯(lián)的內(nèi)在機(jī)制尚不明確。筆者推測，TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)多態(tài)性可能參與了相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，T等位基因突變可能會(huì)引發(fā)Th2細(xì)胞的分化與增殖，從而導(dǎo)致了Th1/Th2細(xì)胞的失衡，誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。

針對(duì)TIM-4基因單核苷酸多態(tài)性和哮喘關(guān)系的一些研究結(jié)論也存在分歧。國內(nèi)如蔡鵬程[20]發(fā)現(xiàn)TIM-4啟動(dòng)子區(qū)rs6882076位點(diǎn)的多態(tài)性與湖北地區(qū)兒童哮喘易感性無相關(guān)性，但Zhao等[18]則認(rèn)為該位點(diǎn)多態(tài)性與中國漢族人哮喘的敏感度相關(guān)。筆者推測，TIM-4基因的單核苷酸多態(tài)性與哮喘的關(guān)系和很多其他基因一樣，可能也存在地域差異?？紤]到本文研究地域較為局限，且研究人數(shù)有限，相關(guān)結(jié)論期待更大樣本、多中心的研究進(jìn)一步明確。

總之，TIM-4基因多態(tài)性與兒童哮喘的相關(guān)性可能存在著種族、民族和地區(qū)差異。本研究發(fā)現(xiàn)浙江臺(tái)州地區(qū)漢族兒童人群中，TIM-4基因rs6874202位點(diǎn)多態(tài)性與兒童的哮喘遺傳易感性存在一定相關(guān)，TIM-4基因相關(guān)位點(diǎn)的篩查將有利于兒童哮喘的預(yù)防和治療。