陳希妍， 楊飛云， 楊亞琴， 牛麗丹， 馬彥娟， 石金河， 郝同琴

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科(河南衛(wèi)輝 453100)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急腹癥之一，是由多種病因?qū)е乱认賰?nèi)胰酶被激活從而引發(fā)胰腺組織自身的炎癥反應(yīng)[1]，因其病死率極高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。AP發(fā)生時，胰腺腺泡細(xì)胞損傷激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，進(jìn)一步損傷腺泡細(xì)胞[2-3]。研究顯示miRNA-155在炎癥、免疫反應(yīng)等方面具有重要作用[4]，AP患者血漿miRNA-155表達(dá)升高，其表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[5]，地塞米松(dexamethasone，DEX)可能通過抑制核因子-κB(NF-κB)的活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減輕胰腺腺泡壞死，降低胰腺組織的損傷[6-7]，但AP時，DEX是否可抑制miRNA-155的表達(dá)，進(jìn)一步影響NF-κB信號通路的活化而發(fā)揮胰腺保護(hù)作用還鮮見報道。2018年10月至2019年9月，本研究將利用蛙皮素建立小鼠AP模型，進(jìn)一步探索DEX在對胰腺腺泡細(xì)胞保護(hù)中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康C57BL/6J小鼠40只購自于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，均為雄性小鼠，體重25～30 g，經(jīng)實驗動物福利委員會許可，實驗動物使用許可證號：SYXK(豫)2011-0001。實驗動物被隨機(jī)分為3組，對照組10只，模型組15只，地塞米松組(DEX組)15只。

1.2 實驗試劑 兔抗磷酸化p65(p-p65)多克隆抗體(SAB4504488)，兔抗p-IκBα多克隆抗體(I0505)，兔抗GAPDH抗體購自于美國Sigma公司。

1.3 動物模型的制備 小鼠AP模型的建立參考文獻(xiàn)[8]并進(jìn)行改良，參照楊飛云等[7]研究者的方法，用生理鹽水將蛙皮素稀釋成10 μg/mL的濃度，按照50 μg/kg的劑量腹腔注射小鼠，連續(xù)注射3次，每次間隔2 h；DEX組在每次注射過蛙皮素后注射腹腔注射DEX(1 mL/kg)；對照組為連續(xù)3次注射生理鹽水。所有動物在最后1次注射后2 h處死，收集各組實驗動物的血液及胰腺組織。

1.4 胰腺組織中miRNA-155水平的測定 利用Trizol Reagent提取各組實驗動物的胰腺組織中總RNA，利用RT-qPCR法檢測各組實驗動物胰腺組織中miRNA-155 mRNA的表達(dá)變化。將各組胰腺組織分別放于高壓消毒過的研缽中，加入液氮，研磨組織至粉末狀后移至1.5 mL Ep管中，利用Trizol Reagent提取總RNA，檢測總RNA的濃度及純度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列由上海生工設(shè)計并合成(miRNA-155上游引物5′-GCTTCGGTTAATGCTAATCGTG-3′，下游引物5′-CAGAGCAGGGTCCGATTGA-3′)，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，RT-qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 30 s，變性94℃ 5 s、退火55℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.5 胰腺組織中p65及IκBα蛋白水平的表達(dá) 利用RIPA裂解液提取各組實驗動物胰腺組織中的總蛋白，利用Western blot法檢測各組胰腺組織中p-p65及p-IκBα蛋白的表達(dá)變化。將各組實驗動物胰腺組織分別放于高壓消毒過研缽中，研磨組織至粉末狀后移至1.5 mL Ep管中，加入適量的RIPA裂解液后，將Ep管放置于冰上30 min，然后12 000×g，4℃離心15 min，取上清，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。利用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至NC膜后5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗孵育p-p65抗體(1∶1 000)，p-IκBα抗體(1∶2 000)，GAPDH抗體(1∶10 000)4 ℃過夜，熒光二抗(1∶10 00)室溫孵育2 h后，曝光，采集圖像，利用Image J軟件分析灰度值。

1.6 胰腺組織勻漿中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的測定 將各組實驗動物胰腺組織于生理鹽水中攪碎勻漿化，再將勻漿的胰腺組織3 000 r/min離心10 min，離心后收集上清液，采用ELISA法測定各組實驗動物胰腺組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平。

1.7 血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平測定 將收集的各組實驗動物血液，3 000 r/min離心10 min，離心后取上清，采用ELISA法測定各實驗動物血清中的IL-1β、IL-6及TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗動物胰腺組織中miRNA-155 mRNA的表達(dá)結(jié)果 與對照組相比較，模型組動物胰腺組織中miRNA-155 mRNA的相對表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而與模型組相比較，DEX組動物胰腺組織中的miRNA-155 mRNA的相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組動物組織中miRNA-155 mRNA的相對表達(dá)量

2.2 各組動物胰腺組織中p-p65及p-IκBα蛋白的表達(dá)結(jié)果 對照組動物胰腺組織中p-p65及p-IκBα蛋白的表達(dá)水平較低，與對照組相比較，模型組動物胰腺組織中p-p65及p-IκBα蛋白的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而與模型組相比較，DEX組動物胰腺組織中的p-p65及p-IκBα蛋白的表達(dá)水平則顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.001)。見圖1、表2。

圖1 p-p65與p-IκBα蛋白在各組動物胰腺組織中的表達(dá)電泳圖

表2 各組動物組織中p-p65及p-IκBα蛋白表達(dá)的相對灰密度值

2.3 各組動物胰腺組織中及血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平 與對照組比較，模型組動物胰腺組織與血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而與模型組相比較，DEX組動物胰腺組織與血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表3、4。

3 討論

AP是多種原因引起胰酶在胰腺自身內(nèi)激活，進(jìn)而引起胰酶對胰腺自身組織的消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng)，AP是胰腺突發(fā)性炎癥，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素，包括活化的胰酶、細(xì)胞因子、趨化因子等[9]，最終導(dǎo)致腺泡細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，其最終結(jié)果是腺泡細(xì)胞的壞死或凋亡。研究顯示腺泡細(xì)胞的壞死與胰腺炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而腺泡細(xì)胞的凋亡與胰腺炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，因此，促使細(xì)胞壞死，抑制細(xì)胞凋亡可加重AP的惡化[10]。如何采取有效的方式減少腺泡細(xì)胞壞死，促進(jìn)其凋亡可成為治療AP的新的思路。

表3 3組實驗動物胰腺組織中TNF-α、IL-6及IL-1β水平的比較

表4 3組實驗動物血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平的比較

DEX是一種類固醇藥物，可以改善微循環(huán)，抑制酶和炎癥介質(zhì)[11]，臨床上應(yīng)用其治療AP[12-13]。動物實驗研究顯示，DEX可以通過上調(diào)Bax基因蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞的凋亡，從而減輕胰腺組織炎癥[14-16]。

在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過程中，microRNA作為一種非編碼的RNA，可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而發(fā)揮重要的作用[17-18]。研究顯示，miRNA-155作為炎性調(diào)控因子在AP病理過程中發(fā)揮重要的作用，通過抑制miRNA-155的表達(dá)，可顯著改善模型動物胰腺的病理學(xué)損傷[19]。臨床研究顯示，AP患者血漿miRNA-155水平升高，且水平升高程度與病情嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[5]。那么在AP動物模型中miRNA-155的表達(dá)會有什么樣的變化呢？

因此，我們利用AP動物模型檢測miRNA-155 mRNA在實驗動物胰腺組織中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，模型組動物胰腺組織中miRNA-155 mRNA的水平顯著高于對照組，這也與臨床研究相一致，而與模型組相比較，使用DEX治療后，動物胰腺組織中miRNA-155 mRNA的水平顯著降低，說明DEX對miRNA-155 mRNA的表達(dá)有抑制作用，可降低AP動物胰腺組織中miRNA-155的表達(dá)。

楊飛云等[7]的研究顯示，DEX可通過抑制NF-κB的活性，促進(jìn)胰腺腺泡的凋亡，而減少其壞死。杜瑩等[20]的研究顯示,敲減miRNA-155后可抑制NF-κB的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。DEX是否是通過抑制miRNA-155的表達(dá)而抑制NF-κB信號通路的活化呢？

本研究結(jié)果顯示，使用DEX治療后，不僅動物胰腺組織中的miRNA-155的表達(dá)降低，而且NF-κB信號通路中p-p65和p-IκBα蛋白的水平也顯著下降。同時，使用DEX治療后，動物胰腺組織與血清中的TNF-α、IL-6及IL-1β的水平均顯著降低。這些結(jié)果提示，DEX可能通過抑制miRNA-155的表達(dá)，進(jìn)一步抑制NF-κB信號通路中的p65和IκBα蛋白的磷酸化，從而抑制NF-κB信號通路的活化，促進(jìn)受損的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，而減少其壞死，減少炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β等的釋放，對胰腺腺泡細(xì)胞起到保護(hù)作用。作為一種微小RNA，miRNA-155在胰腺腺泡損傷中的作用，還有待進(jìn)一步研究，下一步我們將利用體外培養(yǎng)的腺泡細(xì)胞，進(jìn)一步研究miRNA-155在胰腺腺泡損傷中的作用機(jī)制，為臨床以miRNA-155為靶點的AP的治療提供更多的實驗依據(jù)。