馬西, 杜鵬程, 寧登, 劉秋夢(mèng), 陳勁, 程琪, 陳孝平, 姜立△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1膽胰外科， 2肝臟外科(湖北武漢 430030)

結(jié)腸癌是常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病之一，其發(fā)病率和病死率均較高，患者預(yù)后狀況較差[1-2]。在結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是加重其病情和治療困難程度以及影響預(yù)后的重要因素[3]。而腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移受到多種基因和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，這些信號(hào)分子通路影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移，影響腫瘤發(fā)展，其中白細(xì)胞介素(IL)-13、COX2、PI3K/Akt信號(hào)通路等均被證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[4-6]。2018年7月至2019年7月本研究亦關(guān)注IL-13、COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，分析其在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中可能作用機(jī)制，旨在為結(jié)腸癌靶向干預(yù)提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞來源：結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8購自中科院上海生命科學(xué)院研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。相關(guān)試劑來源：RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司)、RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒和SYBR Premix EX Taq(日本Takara公司)、ddH2O (上海索寶生物科技有限公司)、胰蛋白酶(上海江萊生物科技有限公司)、IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1、p-AKT BCA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)、多聚甲醛(武漢西祺生物科技有限公司)、結(jié)晶紫(北京酷來搏科技有限公司)、IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1 PCR 擴(kuò)增引物序列(上海生物工程公司)、人IL-13(上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司)、γ干擾素(IFN-γ)(北京百奧萊博科技有限公司)。檢測儀器設(shè)備來源：3111 型 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國 Forman Scientific 公司)、離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)、醫(yī)用恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)、顯微鏡(日本Nikon公司)、離心管、玻璃瓶、吸管、試管等(江蘇佳美儀器有限公司)、低溫冰箱(日本 Sanyo 公司)、SW-CY-1F 型凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)、微量移液器(德國 Eppendorf 公司)、PCR基因擴(kuò)增儀(美國BIORAD 公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、顯微圖像分析系統(tǒng)(美國 Image 公司)、Transwell 小室(美國corning 公司)、滅菌吸樣槍頭(京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、測微尺(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)在含10%的新鮮胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，在恒溫培箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分組和處理 將體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞分為A組、B組和C組。A組經(jīng)IL-13單獨(dú)作用、B組無IL-13或IFN-γ作用，C組經(jīng)IFN-γ單獨(dú)作用。其中A組細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞濃度1.5×105·mL-1，經(jīng)30 μL 10 ng/mL濃度的IL-13處理，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。B組未經(jīng)IL-13或IFN-γ作用，添加30 μL培養(yǎng)液，細(xì)胞接種狀況和培養(yǎng)環(huán)境同A組。C組細(xì)胞接種狀況和培養(yǎng)環(huán)境同A組，經(jīng)30 μL的 4×105μg/L IFN-γ處理，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RT-PCR法和Western blot法檢測 RT-PCR法檢測3組體外培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測3組結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的蛋白表達(dá)水平，3組取樣時(shí)間均為添加相應(yīng)物品處理前和處理48 h。

RT-PCR：根據(jù)試劑盒和儀器說明書，常規(guī)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成樣本 cDNA。以 GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR 檢測各樣本目標(biāo)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，基因PCR 擴(kuò)增引物序列具體如下：IL-13：F:5′-TTGGCTGCTGACCCAGTAGC-3′；R:5′-ATAGTCTTCGTTACGAACCA-3′。COX2：F:5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAATTGCT-3′；R: 5′-AGATCATCTGTGCCTGAGTATGTTT-3′。PIK3CA：F:5′-ATTTCTTCCTAACTGCAGCG-3′；R: 5′-ATGGCAGCAGGCTTATACAGATAA GAC-3′。Akt1：F:5′-TCAGTAGCATCCGGCAATATC-3′；R:5′-TGCTGCAATCAAAGCCACAGTC-3′。GAPDH：F:5′-CCCATGGCAAATTCCATGGCACCG-3′；R:5′-GTCATGGATGACCTTGGCCAGGGG-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：2 μL的cDNA、1 μL的目標(biāo)基因的Forward Primer、1 μL的目標(biāo)基因的Reverse Primer、10 μL的2×Easy Taq PCR SurperMix，最后通過ddH2O 將反應(yīng)體系體積增加至 20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 變性0.5 min、64℃退火 0.5 min、72℃延伸 45 s，共33個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物常規(guī)行瓊脂糖凝膠電泳和成像系統(tǒng)掃描，各目標(biāo)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為目標(biāo)基因與內(nèi)參灰度值比。

Western blot：取待檢測樣本，以20 000 r/min轉(zhuǎn)速、3 cm半徑離心10 min后，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，10 000 r/min、3 cm半徑離心5 min，棄上清液，添細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，12 000 r/min、3 cm半徑離心15 min，取上清液5 μL，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，以BCA法測定各目標(biāo)蛋白濃度，檢測嚴(yán)格參照試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行。

1.2.4 侵襲實(shí)驗(yàn) 通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察比較兩組細(xì)胞的侵襲能力。3組添加相應(yīng)物品處理前和處理48 h均取細(xì)胞進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)時(shí)取待檢測細(xì)胞，200 μL 5×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，添加4%多聚甲醛，固定0.5 h后以0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下放大200倍觀察穿膜細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。

1.2.5 遷移實(shí)驗(yàn) 通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察比較兩組細(xì)胞的48 h轉(zhuǎn)移能力狀況，3組添加相應(yīng)物品處理前和處理48 h均取細(xì)胞進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)時(shí)取待檢測細(xì)胞，以200 μL 5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁生長，以200 μL滅菌吸樣槍頭劃痕，隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，測微尺測量劃痕間隙距離，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察已選定劃痕的5個(gè)視野并照相，測微尺再次測量劃痕間隙距離，遷移距離為2次劃痕間隙距離之差。

2 結(jié)果

2.1 3組處理前后細(xì)胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與B組比較，A組處理后細(xì)胞COX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量提高，C組處理后細(xì)胞IL-13、COX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低；與C組比較，A組處理后細(xì)胞IL-13、COX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量較高(P<0.05)。與處理前比較，A組處理后細(xì)胞COX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均提高，C組處理后細(xì)胞IL-13、COX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組處理前后細(xì)胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 3組處理前后細(xì)胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的蛋白表達(dá)水平比較 Western blot檢測結(jié)果顯示，與B組比較，A組處理后細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均提高，C組處理后細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與C組比較，A組處理后細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT蛋白表達(dá)水平均較高(P<0.05)。與處理前比較，A組處理后細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均提高，C組處理后細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT的蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組處理前后細(xì)胞IL-13、COX2、PIK3CA、Akt1的蛋白表達(dá)水平比較

2.3 3組處理前后遷移距離和Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)比較 3組中，處理后，A組48 h細(xì)胞遷移距離最長且Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)最多，其次為B組，再次為C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與處理前比較，A組作用后細(xì)胞48 h細(xì)胞遷移距離和Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)均較處理前增加，C組IFN-γ處理后48 h細(xì)胞遷移距離和Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)均較處理前減少(P<0.05)。見表3。

表3 3組處理前后遷移距離和Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

結(jié)腸癌為常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其在老年人群中的發(fā)病率較高，而近年來隨著人類平均壽命延長且老齡化加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病率亦逐年升高，已成為嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全的惡性腫瘤疾病[7-9]。結(jié)腸癌的治療干預(yù)方法中，手術(shù)、化療等的應(yīng)用較多，但仍有部分患者療效欠佳，預(yù)后狀況較差[10-11]。尋找新的有效治療方法提高結(jié)腸癌療效和改善其預(yù)后狀況是目前急需解決的醫(yī)學(xué)難題之一。

隨著生物醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，腫瘤治療干預(yù)措施不斷改進(jìn)，而靶基因治療已成為惡性腫瘤治療的熱門方向。遺傳因素為惡性腫瘤重要影響因素，結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展均涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路[12]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移不但可加重其病情，在腫瘤治療干預(yù)中亦可使其治療的困難程度增加，影響治療效果，甚至引發(fā)死亡等不良預(yù)后狀況的發(fā)生[13]。臨床上，在結(jié)腸癌中，患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率可超過30%，嚴(yán)重影響療效和預(yù)后。因此，對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面進(jìn)行干預(yù)亦是其治療干預(yù)的重要環(huán)節(jié)之一。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移亦與多種基因和信號(hào)分子通路相關(guān)[14]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展中免疫炎癥扮演著重要角色，而IL-13為與免疫炎癥密切基因，在多種惡性腫瘤中的表達(dá)水平出現(xiàn)升高，與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等均相關(guān)[15]。此外COX2、PI3K/Akt信號(hào)通路等亦與腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)[16]。因此，IL-13、COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路等均可能與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能作為其靶向干預(yù)信號(hào)分子通路。因此，本研究分析IL-13、COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞IL-13、COX2、PI3K、Akt的mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均較高，而IL-13作用可同時(shí)提高其中COX2 的mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT蛋白表達(dá)水平，而IFN-γ作用可同時(shí)降低IL-13、COX2 的mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞IL-13、COX2、p-AKT蛋白表達(dá)水平，提示IL-13可能調(diào)控COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路，影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。且本研究中IL-13作用提高IL-13表達(dá)的情況下，結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞48 h細(xì)胞遷移距離延長且Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)增多，而IFN-γ抑制IL-13表達(dá)的情況下，結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞48 h細(xì)胞遷移距離縮短且Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)減少，提示IL-13在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，與此同時(shí)，COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路隨著IL-13表達(dá)變化而變化，提示IL-13可能通過上調(diào)COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。IL-13、COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路均可能用于結(jié)腸癌靶向治療，尤其是IL-13抑制可能是減少結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移和提高療效的有效方法之一，這尚需進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

綜上所述，IL-13、COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路均可影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移，而IL-13上調(diào)COX2 和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)從而促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移可能為其作用機(jī)制。