文/何智燕 王蓓蓓

（揚州大學旅游烹飪學院）

乳制品安全是關乎健康的重大民生問題。四環(huán)素類抗生素是養(yǎng)殖業(yè)中常用的獸藥和飼料添加劑，具有抑菌范圍廣、殺菌能力強、成本低廉等優(yōu)點，作為牛奶中常用的添加抗生素，其殘留問題受到人們的日益關注。長期食用含有四環(huán)素類抗生素的乳制品容易造成肝和腎臟的損傷，引發(fā)過敏和中毒反應，還會使牙齒變黃，嚴重影響人類的身體健康[1，2]。檢測四環(huán)素有很多種方法，但是大多數(shù)都比較繁瑣，其中ELISA可以對樣品進行直接檢測，但需要多次洗滌、加液、顯色等操作步驟；而膠體金免疫層析法檢測靈敏度只能達到50～100 μg/L[3]。

碳點是一種新型的碳基零維材料，具有優(yōu)秀的光學性質、良好的水溶性、低毒性、環(huán)境友好、原料來源廣、成本低、生物相容性好等諸多優(yōu)點。碳點大多具有sp2雜化碳的骨架結構，其表面帶有大量碳的含氧基團[4～7]（如羥基、羧基等），表現(xiàn)出優(yōu)良的熒光性能，如耐光漂、非閃爍、發(fā)射波長可調(diào)、上轉換性能等。因此，可以和其他碳納米材料（碳納米管、石墨烯、富勒烯、納米金剛石等）在材料科學、生物化學、電子器件以及生物醫(yī)學等方面發(fā)揮同等重要的作用[8～10]。

在前人研究的基礎上，本文以L-型半胱氨酸、五氧化二磷和水反應合成熒光碳點（CDs），經(jīng)離心獲得碳點溶液，以其作為熒光探針進行一定濃度的稀釋，在pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖溶液中，以檢測對象四環(huán)素對其有猝滅現(xiàn)象為機理，建立一種快捷、靈敏檢測微量四環(huán)素含量的熒光分析法。該試驗對四環(huán)素含量的測定方法，已初步應用在實際牛奶樣品的檢測中，且該方法具有操作簡單、選擇性高、試驗成本低、靈敏應用范圍廣等特點。

1 材料與設備

1.1 主要材料與試劑

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（Tris-HCl）；四環(huán)素標準溶液。

1.2 儀器與設備

臺式離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司；熒光分光光度計：上海棱光技術有限公司；紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 碳點的制備

分別稱取0.04 g L-半胱氨酸和2.50 g五氧化二磷置于潔凈的燒杯中，混合均勻，量取2.0 mL純水一次性加入該燒杯中，產(chǎn)生劇烈反應，爆出大量白煙后得到棕黃色、略有黑點的透明溶液，將其轉移置于離心機中離心（5 000 r/min，5 min），取上清液，放置一段時間，多次重復上述離心的上清液所得的碳點置于4 ℃冰箱中保存，用于進一步的鑒定和使用。

2.2 碳點的表征

在常溫條件下，取碳點原液置于比色皿中，在紫外-可見分光光度計中測定其紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。在測碳點溶液熒光光譜時，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，掃描電壓為900 V，掃描速度為1 000 nm/min，激發(fā)波長為380 nm。在上述條件下，改變激發(fā)波長（310～390 nm），測定不同激發(fā)波長下對應碳點的熒光光譜。

2.3 四環(huán)素猝滅熒光碳點的反應機理探討

2.3.1四環(huán)素對熒光碳點的初步測量

在pH值為7.4的PBS中，加入一定量的碳點溶液和1.0×10-4mol/L的四環(huán)素溶液，以不添加四環(huán)素的碳點溶液為空白對照，于熒光分光計中檢測，觀察添加四環(huán)素碳點溶液的熒光變化。

取等量的碳點溶液，分別加入不同濃度的四環(huán)素溶液，置于紫外燈下觀察不同濃度的四環(huán)素對碳點熒光的猝滅情況。

2.3.2不同濃度的四環(huán)素對碳點的熒光猝滅情況檢測

在pH值7.4的PBS中，加入一定濃度的碳點溶液，再加入不同濃度的四環(huán)素溶液，經(jīng)反應一定時間后，檢測碳點的熒光猝滅情況。以不加四環(huán)素的碳點溶液為對照組。

2.4檢測條件的優(yōu)化

2.4.1體系中pH值的優(yōu)化

為確定體系的最佳反應pH值，在最佳的碳點使用濃度和反應時間下進行pH值的優(yōu)化，即在pH值6.6、7.0、7.2、7.4、8.0下，分別檢測體系熒光變化量。

2.4.2反應時間的優(yōu)化

為確定該體系的最佳反應時間，在最佳的碳點使用濃度和pH值下，配制5組體系，前4組每隔5min檢測1組體系，后1組每隔15min檢測1次，最終測得5組的熒光改變量。

2.4.3反應溫度的優(yōu)化

為確定體系的最佳反應溫度，在最佳的碳點使用濃度、pH值和反應時間下，配制 5 組體系，每組體系的溫度分別設為0 ℃、5 ℃、15 ℃、25 ℃、50 ℃，分別檢測各組熒光改變量。

3 結果與分析

3.1 碳點的光譜表征

如圖1可見，該碳量子點在紫外光區(qū)300～500 nm有很強的吸收，在此波段內(nèi)隨波長的增加而吸收強度逐漸減弱。

圖2可觀察到該方法制得的碳點具有很高的熒光性，且最高熒光強度已經(jīng)超越了儀器的量程，因此可以適當稀釋碳點濃度，以方便試驗的進行。

圖3為不同激發(fā)波長下碳點的熒光發(fā)射峰。由圖可見，碳點在不同的激發(fā)波長下均有熒光發(fā)射峰。隨著激發(fā)波長的增大，熒光強度先增大后減小，熒光峰位置不變，說明該方法合成的熒光碳點的熒光峰的位置不受激發(fā)波長影響。以380 nm為激發(fā)所得出的熒光峰值最高，確定后續(xù)試驗選擇380 nm為碳點的最佳激發(fā)波長。

3.2 四環(huán)素對碳點的熒光猝滅作用

圖4為380 nm激發(fā)波長下，碳點溶液（a）以及添加四環(huán)素的碳點溶液（b）的熒光發(fā)射光譜圖。從圖中很明顯看出，加入四環(huán)素的碳點溶液熒光峰有很明顯的下降，說明四環(huán)素對碳點有明顯的猝滅作用。

圖1 碳點的紫外吸收光譜

圖2 碳點的熒光發(fā)射光譜

3.3 四環(huán)素猝滅碳點熒光的反應機理的探討

本試驗探討了四環(huán)素濃度對碳點猝滅的規(guī)律性。圖5為在pH值為7.4的PBS中，加入一定量的碳點溶液，再分別加入不同濃度的四環(huán)素，以得到碳點的熒光發(fā)射光譜變化圖。

圖3 不同激發(fā)波長下碳點的熒光值變化趨勢

圖4 380 nm激發(fā)波長下，碳點溶液（a）以及添加四環(huán)素的碳點溶液（b）的熒光發(fā)射光譜圖。

從圖5可知，隨著四環(huán)素的濃度不斷增加，碳點的熒光強度逐漸下降，但是其熒光峰值的波長仍然在435 nm左右。結果說明，加入四環(huán)素后體系發(fā)生變化，導致碳點的熒光猝滅。分析原因可能是由于四環(huán)素可以和熒光碳點表面的羥基和羧基發(fā)生絡合反應[11]，從而產(chǎn)生非特異性相互作用，對碳點的熒光產(chǎn)生猝滅所致[12]。而且這種下降的梯度具有規(guī)律性，線性關系趨勢很明顯，由此可以構建一種以熒光碳點的猝滅機理來檢測四環(huán)素含量的方法。

3.4 檢測條件的優(yōu)化

3.4.1 體系中pH值的優(yōu)化

針對四環(huán)素對碳點猝滅的反應pH值進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)反應pH值在7.4時，四環(huán)素對碳點的猝滅已經(jīng)達到最大，再繼續(xù)反應，效果稍有不佳，猝滅也趨于穩(wěn)定，故本試驗將反應pH值確定為7.4（圖6）。

3.4.2 反應時間對體系熒光改變量?F的影響

針對四環(huán)素對碳點猝滅的反應時間進行優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)反應時間在5 min時，四環(huán)素對碳點的猝滅已經(jīng)達到最大，再繼續(xù)反應，效果稍有不佳，猝滅也趨于穩(wěn)定，故在本試驗后的反應時間確定為5 min（圖7）。

3.4.3 反應溫度對體系熒光改變量?F的影響

針對四環(huán)素對碳點猝滅的反應溫度進行優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)反應溫度在25℃時，四環(huán)素對碳點的猝滅已經(jīng)達到最大，其它溫度下也有改變，但均小于此溫度下的熒光變化量，故在本試驗的反應溫度確定為25℃（圖8）。

3.5標準曲線和檢出限

在上述各種優(yōu)化條件下進行檢測，考察碳點在檢測四環(huán)素的線性范圍以及最低檢出限，并根據(jù)試驗結果繪制了標準曲線，結果如圖9所示。試驗結果表明，當四環(huán)素濃度在1.0×10-2～1.0×10-7mol/L范圍增加時，檢測體系的整體熒光強度隨之呈規(guī)律性的下降趨勢。以四環(huán)素濃度以10為底的對數(shù)值為 X，以碳點的熒光變化量ΔF為Y，建立線性回歸方程Y=106.09X+835.51，線性相關系數(shù)為0.9728。以不添加四環(huán)素的碳點體系溶液作為空白溶液，平行測定10 次，以3倍信號強度的標準偏差除以轉換后的標準曲線斜率，最終得到的檢出限為4.3×10-7mol/L。

圖5 不同濃度的四環(huán)素對碳點的熒光猝滅作用

圖6 pH值對體系熒光猝滅的影響

圖7反應時間對碳點的熒光猝滅的影響

3.6 實際樣品中四環(huán)素含量的測量

本試驗以伊利純牛奶樣品作為研究測定對象，經(jīng)過脫脂、稀釋等前處理后得到10-1和10-22個稀釋度，在稀釋的體系中加標樣品檢測其熒光猝滅，帶入標準曲線計算出標準方差、回收率。結果得出表1，其標準差分別為0.0125和0.035，回收率為123%和120%，回收率較高原因可能是所檢測樣品中本來就含有微量的四環(huán)素。

4 討論

乳制品中四環(huán)素類藥品殘留的快速檢測方法有很多種，本試驗建立的熒光分析方法具有較高的靈敏度和選擇性，且合成碳點的方法簡單、方便、快捷，熒光性良好且穩(wěn)定。在進行正式試驗前，通過大量預試驗的比較分析，得出時間、pH值、溫度這3 個因素對熒光猝滅的影響比較大。因此，本試驗選定這3 個因素，分別進行優(yōu)化試驗，然后在優(yōu)化條件下得出良好的線性方程Y=106.09X+835.51，較高的相關系數(shù) 0.9728，較寬的檢測線性范圍級檢出限4.3×10-7mol/L，測定不同濃度的四環(huán)素對碳點熒光猝滅的影響。本試驗檢測牛奶樣品測得的回收率超過100%，可能是所測樣品本身含有微量的四環(huán)素存在。本方法實現(xiàn)其定性檢測的高效性和定量檢測的準確性，寄希望在深入開展乳制品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測技術中提供一條新的技術路線

表1 實際樣品的檢測

圖8 反應溫度對碳點的熒光猝滅的影響

圖9 熒光強度變化量與四環(huán)素濃度之間的線性關系