文/董 菡 張倩瑤 成玉梁 于 航 謝云飛 姚衛(wèi)蓉 郭亞輝＊ 錢(qián) 和

（1江南大學(xué)食品學(xué)院；2浙江省杭州市桐廬縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心）

乳中幾乎含有人體所需要的全部營(yíng)養(yǎng)素和大量具有保健功能的生物活性物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非常豐富。隨著乳和乳制品種類的日益增多，其在國(guó)民飲食中的地位不斷提高，目前中國(guó)已成為全球最大的乳制品新興市場(chǎng)[1]。但乳和乳制品的質(zhì)量問(wèn)題也隨之成為公眾焦點(diǎn)。其中，抗生素作為乳牛防病、治病的通用藥劑被廣泛用于動(dòng)物藥品和飼料添加劑中?？股貙?duì)人體健康存在潛在的威脅，抗生素的不規(guī)范應(yīng)用一方面會(huì)導(dǎo)致乳制品發(fā)酵異常，使產(chǎn)品理化性質(zhì)發(fā)生改變，影響后期風(fēng)味形成[2]；另一方面，會(huì)增加致病菌耐藥性，提高食用者的疾病治療成本，且過(guò)量抗生素會(huì)破壞人體正常菌群間的相互制約機(jī)制，擾亂機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡[3]。

畜牧業(yè)乳產(chǎn)中常用的抗生素主要有青霉素類、四環(huán)素類、β -內(nèi)酰胺類、鏈霉素類等。近年來(lái)，我國(guó)乳制品抗生素殘留現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。2013年對(duì)江蘇省蘇州市生乳和零售牛乳制品中β -內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)，其中牛乳制品中檢出率為3.2%，生乳中檢出率為41.7%[4]；2013年對(duì)鎮(zhèn)江地區(qū)市售純牛奶和奶源戶生鮮牛奶中抗生素殘留情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示抗生素殘留陽(yáng)性率為5.86%，其中市售包裝純牛奶陽(yáng)性率4.67%，袋裝純牛奶陽(yáng)性率4.41%，盒裝純牛奶陽(yáng)性率4.79%[5]。其他城市的相關(guān)檢測(cè)結(jié)果也不容樂(lè)觀，由此可見(jiàn)乳制品抗生素殘留現(xiàn)象仍然存在，值得引起高度重視。

根據(jù)《GB/T 4789.27—2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)》，我國(guó)鮮乳中抗生素殘留檢測(cè)使用的方法主要是嗜熱鏈球菌抑制法（TTC法）和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法（戴爾沃檢測(cè)法），兩者皆為微生物測(cè)定法。此外，還有理化檢測(cè)法，如高效液相色譜檢測(cè)法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等[6]。此類方法普遍建立在儀器分析的基礎(chǔ)上，因其鑒定靈敏度和準(zhǔn)確度較高，被廣泛應(yīng)用于乳制品的抗生素殘留檢測(cè)試驗(yàn)，但同時(shí)也存在檢測(cè)程序較復(fù)雜、費(fèi)用較高、人力物力消耗大等缺陷。而試紙法具有操作簡(jiǎn)單、體積輕小、反應(yīng)快速、顯示直觀等特點(diǎn)，比較適合小型實(shí)驗(yàn)室或者現(xiàn)場(chǎng)操作。

試紙法是通過(guò)經(jīng)特殊制備的試紙與待測(cè)成分進(jìn)行反應(yīng)所顯示的變化來(lái)對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行目視或儀器定性的一種快速檢測(cè)方法[7]。目前應(yīng)用在乳品抗生素檢測(cè)中的試紙條主要有膠體金免疫層析試紙條、酶聯(lián)免疫試紙條、熒光免疫層析試紙條、核酸適配體試紙條和生物膜干涉試紙條?？鞕z試紙條的突出優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、攜帶便捷、成本低廉、顯示直觀，可滿足監(jiān)管部門(mén)對(duì)乳品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)初篩檢測(cè)的需求，有望成為乳制品中殘留抗生素檢驗(yàn)的簡(jiǎn)易分析工具。

1 免疫分析試紙條

免疫分析技術(shù)基于免疫學(xué)原理，利用抗原抗體的免疫學(xué)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程來(lái)完成檢測(cè)[8]，目前被廣泛應(yīng)用于制作抗生素快檢試紙條。因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、價(jià)格低廉、適用于大批量樣本檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為快速檢測(cè)方法研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。根據(jù)所用標(biāo)記物的不同，此技術(shù)涉及的乳制品抗生素快檢試紙條主要可分為3類，即膠體金免疫層析試紙條（Colloidal gold immunochromatographic test strip，CGICAs）、熒光免疫層析試紙條（Fluorescence immunochromatographic test strip，F(xiàn)IAs）和酶聯(lián)免疫試紙條（ELISA test strip，ELISAs）。

1.1 膠體金免疫層析試紙條

膠體金免疫層析試紙條（CGICAs）基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)以及固相標(biāo)記技術(shù)，利用膠體金作為固相標(biāo)記物，大孔徑微孔濾膜作為載體，以?shī)A心法或競(jìng)爭(zhēng)法為主要方法定性檢測(cè)樣本中抗生素的存在[9]。目前市場(chǎng)上的快檢試紙條多為膠體金免疫快檢試紙條，其可滿足同時(shí)檢測(cè)多種抗生素的需求，反應(yīng)快速，肉眼即可辨別現(xiàn)象，但相較于其他免疫層析試紙條，膠體金試紙條的靈敏度稍低。

圖1 基于八重側(cè)流免疫測(cè)定法檢測(cè)各抗生素的原理圖[12]

李海龍等[10]利用此類試紙條對(duì)牛奶中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，其對(duì)其他抗生素?zé)o交叉反應(yīng)，且與液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）相比，檢測(cè)結(jié)果符合度可達(dá)100%。美國(guó)3M公司[11]推出的基于膠體金免疫層析技術(shù)的抗生素檢測(cè)試劑條，可準(zhǔn)確、快速、便捷地檢測(cè)乳品中β-內(nèi)酰胺、四環(huán)素、磺胺和喹諾酮類4 種抗生素藥物的殘留，試驗(yàn)證明其靈敏度和特異性均高于95%。

Han等[12]提出了針對(duì)牛奶中四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺、磺酰胺、氯霉素、鏈霉素等抗生素的免疫層析試紙條，此外還可用于黃曲霉毒素M1和三聚氰胺的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間小于20 min。這項(xiàng)產(chǎn)品創(chuàng)新性地提出了八重側(cè)流免疫測(cè)定法（圖1），制備特異性單克隆抗體和受體，將其結(jié)合到金納米顆粒上，形成的8 種抗體金納米顆粒綴合物作為檢測(cè)探針；并合成8 種相應(yīng)的半抗原-蛋白結(jié)合物，將其固定在硝酸纖維素膜的不同測(cè)試區(qū)域上，作為捕獲抗原。此八倍體免疫反應(yīng)可以同時(shí)發(fā)生在單個(gè)條帶上，故可用肉眼目測(cè)進(jìn)行定性分析。而對(duì)于半定量分析，可以使用智能手機(jī)的內(nèi)置攝像頭拍攝測(cè)試線，并用Image J軟件分析強(qiáng)度。試驗(yàn)顯示，所有化學(xué)物質(zhì)的檢出限均遠(yuǎn)低于當(dāng)局設(shè)定的監(jiān)管限度。此項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)的快速篩選牛奶中常見(jiàn)抗生素的免疫測(cè)定法非常有前景。

1.2 酶聯(lián)免疫試紙條

酶聯(lián)免疫試紙條（ELISAs）基于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA），將待測(cè)抗生素的抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，待檢樣品會(huì)與酶標(biāo)抗體和固相載體表面的抗體或抗原反應(yīng)，加入酶反應(yīng)底物顯色后，通過(guò)顏色深淺可以進(jìn)行定性或定量分析（圖2）。酶強(qiáng)大的催化效率可顯著放大反應(yīng)效果，使酶聯(lián)免疫試紙條的檢測(cè)達(dá)到很高的敏感度[13，14]。但酶標(biāo)試紙不能同時(shí)檢測(cè)多種成分，且對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，可與GC、HPLC等檢測(cè)手段聯(lián)合使用，增強(qiáng)其鑒定準(zhǔn)確性。

隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，酶聯(lián)免疫試紙條也增加了更多技術(shù)思路。姜侃等[15]應(yīng)用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)層析技術(shù)設(shè)計(jì)的檢測(cè)乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留試紙條，在使用方便性、檢測(cè)靈敏度、精密度以及交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。Nuryono等[16]設(shè)計(jì)了采用ELISA法對(duì)印度尼西亞牛奶中黃曲霉毒M1殘留的檢測(cè)方法，檢測(cè)限達(dá)5 ng/mL，可用于現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行大量篩選。

1.3 熒光免疫層析試紙條

熒光免疫層析試紙條（FIAs）是一項(xiàng)新興的免疫檢測(cè)試紙條，結(jié)合了免疫反應(yīng)和色譜層析原理，既保留了膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，又增加了熒光免疫技術(shù)的高靈敏度，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品安全的現(xiàn)場(chǎng)篩查。量子點(diǎn)（QDs）是由 II～VI 族或 III～V 族元素組成的新型熒光納米材料，是目前常用的新型熒光標(biāo)記物，被聚合物材料包裹后形成量子點(diǎn)熒光微球（QBs），再結(jié)合待測(cè)抗生素的單克隆抗體制成熒光檢測(cè)探針，由此設(shè)計(jì)的試紙條熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可快速、直觀地篩查殘留抗生素，極具推廣和應(yīng)用價(jià)值[17，18]。

圖2 ELISA雙抗體夾心法圖示

圖3 CG-LFIA，LM-LFIA和TrFM-LFIA條的制備及檢測(cè)原理圖[20]

丁喬琪等[19]以羧基化CdTe /ZnSe量子點(diǎn)熒光微球?yàn)闃?biāo)記物，通過(guò)EDC/NHS活化法將氯霉素（CAP）單克隆抗體與量子點(diǎn)熒光微球偶聯(lián)制備成熒光探針，組裝成新型氯霉素量子點(diǎn)熒光微球免疫層析試紙條。該試紙條可在15 min內(nèi)完成牛奶樣品中CAP的定量檢測(cè)，線性范圍為0.1～100.0μg /L，檢出限為0.1 μg /L。

如圖3所示，Li等[20]建立了3 種側(cè)向免疫層析分析（LFIA）方法，以檢測(cè)牛奶中的泰樂(lè)菌素殘留。該研究應(yīng)用了膠體金（CG）、乳膠微球（LM）和時(shí)間分辨熒光微球（TrFM）在LFIA中用作抗體標(biāo)記示蹤劑，用于檢測(cè)牛奶和豬肉中的泰樂(lè)菌素（TYL）和替米考星（TIM）殘留。CG-LFIA，LM-LFIA和TrFM-LFIA3種方法的臨界值分別為8 ng/mL、4 ng/mL和2 ng/mL，結(jié)果顯示，熒光方法靈敏度顯著高于膠體金方法，且可在5～8 min獲得結(jié)果。通過(guò)此三類LFIAs和LC-MS / MS方法對(duì)40個(gè)牛奶樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，3 種方法之間具有良好的相關(guān)性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。結(jié)果表明，這3 種測(cè)定方法可以提供快速、可靠的檢測(cè)結(jié)果，能為現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定大量樣品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素或其他污染物殘留提供多種技術(shù)支持。

2 核酸適配體試紙條

適配體（Aptamer）是一段DNA或RNA序列，通常通過(guò)指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選獲得，可與相應(yīng)的靶標(biāo)高親和力、特異性結(jié)合。核酸適配體試紙條（Aptamer-based dipstick assay，ABDs）以核酸適配體作為識(shí)別因子，通過(guò)適配體與抗生素靶標(biāo)結(jié)合，并利用膠體金、量子點(diǎn)等標(biāo)記物質(zhì)呈現(xiàn)的光學(xué)變化進(jìn)行快速檢測(cè)。與傳統(tǒng)的抗原抗體免疫反應(yīng)相比，適配體結(jié)合技術(shù)具有親和力強(qiáng)，篩選過(guò)程簡(jiǎn)單，靶標(biāo)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。趙帥等[21]

設(shè)計(jì)的核酸適配體測(cè)流層析試紙條可高水平檢測(cè)樣品中的氯霉素（CAP）殘留；孫春燕等[22]基于核酸適配體制作的膠體金層析試紙條，將核酸適配體與膠體金結(jié)合，利用四環(huán)素（TCY）與DNA及核酸適配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力的強(qiáng)弱，提供了一種更適于TCY現(xiàn)場(chǎng)快檢的方法。

圖4核酸適配體試紙條測(cè)定黃曲霉毒素（AFB1）的圖示[23]

如圖4所示，Shim等[23]開(kāi)發(fā)了檢測(cè)黃曲霉毒素（AFB1）的核酸適配體半試紙條。該試紙條采用競(jìng)爭(zhēng)法，在生物素修飾的適配體、靶標(biāo)AFB1、Cy-5標(biāo)記的適配體互補(bǔ)序列探針的混合物溶液中插入試紙條。互補(bǔ)序列探針、靶標(biāo)AFB1與適配體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，使生物素標(biāo)記的適配體與靶標(biāo)AFB1，生物素標(biāo)記的適配體與互補(bǔ)序列探針在檢測(cè)線處結(jié)合，因檢測(cè)線處熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)的含量呈負(fù)相關(guān)，故可通過(guò)熒光強(qiáng)度確定AFB1含量，其檢測(cè)限為0.1 ng/mL，以實(shí)現(xiàn)AFB1的半定量檢測(cè)。

表1五類快檢試紙條的對(duì)比分析

圖5生物膜干涉技術(shù)（BLI）原理圖[24]

3 生物膜干涉試紙條

由生物膜干涉技術(shù)（BLI）為原理設(shè)計(jì)的生物膜干涉試紙條（Biofilm interference test strip，BIs）是一類新型的、可定性檢測(cè)乳品中抗生素殘留的快檢方法。其原理是當(dāng)光在同質(zhì)光源中傳播時(shí)，如果傳播距離有差別就會(huì)產(chǎn)生光程差（圖5a），光程差導(dǎo)致光發(fā)生干涉現(xiàn)象，從而使不同波長(zhǎng)光線的干涉形成干涉譜（圖5b）[24]。當(dāng)結(jié)合在生物膜傳感器上的抗生素抗體或適配體與加入的樣品中殘留抗生素結(jié)合時(shí)，會(huì)使生物膜厚度產(chǎn)生變化，導(dǎo)致其上透過(guò)的反射光頻率受到影響（圖5c）[25]。若在其內(nèi)添加熒光標(biāo)記物，即可根據(jù)顏色變化反映現(xiàn)象。生物膜干涉技術(shù)具有可不借助標(biāo)記物而實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)，尤適合于低親和力或解離快速的抗體的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查[26]。

劉小軍等[27]由BLI結(jié)合納米金信號(hào)放大技術(shù)，建立了能檢測(cè)牛乳中β-內(nèi)酰胺類抗生素的快檢試紙條。試驗(yàn)結(jié)果表明，金標(biāo)記的BLI較非標(biāo)記BLI能夠顯著提高檢測(cè)的靈敏性，比采用相同原料制備的免疫層析試紙條靈敏度高1倍，能快速、有效地檢測(cè)出樣品中抗生素的存在。陳軍[28]以氯霉素半琥珀酸酯為母體，直接偶聯(lián)物固著在傳感器末端形成具有雙層結(jié)構(gòu)的生物膜，通過(guò)檢測(cè)端面生物膜層的厚度變化所引起的光譜相位改變，實(shí)現(xiàn)樣品中氯霉素（CAP）的快速檢測(cè)。雖然該試驗(yàn)表明，采用金標(biāo)記生物膜干涉試紙條檢測(cè)牛乳中抗生素殘留的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)時(shí)間需要90 min以上才能達(dá)到平臺(tái)期，比免疫層析試紙條方法（6 min）的檢測(cè)周期要長(zhǎng)，但該試紙條檢測(cè)氯霉素殘留的靈敏性要明顯高于免疫層析試紙條，故該方法仍是一種簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法，可以用于牛乳中氯霉素抗生素殘留的快速檢測(cè)。

4 小結(jié)

隨著乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，乳品中的抗生素殘留問(wèn)題已越來(lái)越多地受到政府和消費(fèi)者的重視。本文主要綜述了各類快檢試紙條在乳品中抗生素檢測(cè)方面的研究進(jìn)展（表1），著重介紹了各類抗生素快檢試紙條的原理、優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用范圍?？鞕z試紙條具有攜帶便捷、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速、現(xiàn)象直觀、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，在乳與乳制品殘留抗生素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中具有良好前景。加大此類快檢試紙條的研發(fā)與推廣，能有效降低乳制品中抗生素檢測(cè)的成本，大大提高乳制品中抗生素檢出的準(zhǔn)確率，嚴(yán)格限制抗生素的非法添加，為人們的乳飲生活提供保障。