胡小虎，孫文軍，高昕，王夕靜

1.西安千禾藥業(yè)股份有限公司，陜西 西安 710075；2.西安新通藥物研究有限公司，陜西 西安 710077；3.西安交通大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 710061

葛蘭心寧軟膠囊為西安千禾藥業(yè)股份有限公司開發(fā)的由成分明確的葛根總黃酮、山楂提取物、絞股藍(lán)總皂苷組成的中藥復(fù)方制劑，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，臨床用于預(yù)防和治療瘀血閉阻所致的冠心病、心絞痛[1]。其主要組成組分絞股藍(lán)總皂苷由絞股藍(lán)提取制成，主要活性成分為達(dá)瑪烷型皂苷類物質(zhì)，含量較高，具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等顯著作用[2]，其中含量較大的皂苷為絞股藍(lán)皂苷A(結(jié)構(gòu)式見圖1)。文獻(xiàn)[3]報(bào)道了用高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器(HPLC-UV)測定絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷A的含量、文獻(xiàn)[4]報(bào)道了用高效液相串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定絞股藍(lán)中絞股藍(lán)皂苷A的含量，但尚未有絞股藍(lán)皂苷A有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法(UPLC-MS)建立葛蘭心寧軟膠囊中絞股藍(lán)皂苷A的體內(nèi)分析方法，進(jìn)行絞股藍(lán)皂苷A的大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究，為葛蘭心寧軟膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供方法學(xué)參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 絞股藍(lán)皂苷A的結(jié)構(gòu)式

1 材料

Waters UPLC H-Clas/Xevo TQD型超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(QSM四元梯度泵、FTN自動(dòng)進(jìn)樣器、6通道在線脫氣機(jī)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)MassLynx V4.1，美國Waters公司)；德國Sartorius BS124S型電子天平(0.1 mg，最大稱量120 g，德國賽多利斯公司)；德國Sartorius BT125D型萬分之一/十萬分之一雙量程電子天平[0.01 mg·(0.1 mg)-1，最大稱量41 g·(120 g)-1，德國賽多利斯公司]；TD10001B型電子天平(0.1 g，最大稱量1000 g，余姚市金諾天平儀器有限公司)；ULT2186-4-V -86 ℃立式超低溫冰箱(美國Thermo Revco公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL16M，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；多通道微量移液器(M12-50，德國brand公司)。

葛蘭心寧軟膠囊(批號(hào)：20170603，西安千禾藥業(yè)股份有限公司)；絞股藍(lán)皂苷A對(duì)照品(批號(hào)：DRK-1392-920117，純度：98.9%，成都德瑞可生物科技有限公司)；內(nèi)標(biāo)丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)：MUST-16111007，純度：99.71%，成都曼斯特生物科技有限公司)；甲酸(LC/MS級(jí)，中國國藥控股有限公司)；甲醇(LC/MS級(jí)，德國Merck 公司)；乙腈(LC/MS級(jí)，德國Merck公司)；純化水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

雄性SPF級(jí)SD種大鼠，體質(zhì)量220～250 g[四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2018-19]。動(dòng)物接收后進(jìn)行常規(guī)檢疫和適應(yīng)性觀察，連續(xù)觀察7 d，每天1次。IVC獨(dú)立送風(fēng)大鼠飼養(yǎng)系統(tǒng)，四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-008。飼養(yǎng)溫度：20～26 ℃，相對(duì)濕度：40%～70%，飼養(yǎng)密度1～5只/盒。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜方法

Waters UPLC H-Clas超高效液相色譜儀；Waters CORTECSTMUPLC C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.6 μm)；柱溫45 ℃；流動(dòng)相：A(0.1%甲酸水溶液)-B(0.1%甲酸甲醇溶液)，梯度洗脫(0～1 min，70%B；1～2.5 min，70%～95%B；2.5～4.5 min，95%～100%B；4.5～6.0 min，100%～70%B)，流速0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：Waters UPLC H-Clas/Xevo TQD型超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，電噴霧離子源；正離子檢測；毛細(xì)管電壓：3.0 KV，離子源溫度：120 ℃，去溶劑溫度：350 ℃，去溶劑流速：600 L·h-1，錐孔電壓：30 V，噴霧氣與反吹氣N2，反吹氣流速：50 L·h-1，碰撞氣Ar，碰撞氣流速：0.16 mL·min-1，碰撞能量：15 V，掃描模式MRM；定量分析特征離子，絞股藍(lán)皂苷A：m/z899.35～814.47，內(nèi)標(biāo)丹參酮ⅡA：m/z295.1～206.03。液質(zhì)系統(tǒng)為 MassLynx V4.1。

2.2 給藥方案與血漿樣品采集

2.2.1給藥方案 參照供試品用法用量，計(jì)算60 kg成人日用量為：0.58×2×3÷60≈0.058 g/kg/日。計(jì)算大鼠等效劑量：(dA×kB)÷kA=(0.058×0.71)÷0.11≈0.37 g·kg-1，式中，dA為A種動(dòng)物的給藥計(jì)量；kA為A種動(dòng)物等效劑量的折算系數(shù)；kB為B種動(dòng)物等效劑量的折算系數(shù)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)探索結(jié)果，調(diào)整給藥量為灌胃給予0.5 mL·kg-1。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。給藥1次。

2.2.2血漿樣品采集 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置取血時(shí)間點(diǎn)設(shè)置如下：灌胃給藥前約0.5 h(零時(shí)間)，灌胃給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL。置肝素化試管中，輕輕搖勻，4 ℃ 3000 r·min-1離心10 min分離血漿，-80 ℃保存待測。

2.3 血漿樣品的預(yù)處理

2.3.1空白血漿樣品的預(yù)處理 取大鼠空白血漿，精密量取50 μL，置1.0 mL塑料離心管中，加入200 μL甲醇，渦旋混勻2 min后，置于離心機(jī)中，4 ℃，25 000 r·min-1(離心半徑為5.35 cm)離心10 min，取上清液，進(jìn)行超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS) 分析。

2.3.2含藥血漿樣品 取大鼠血漿50 μL，精密量取，置1.5 mL 塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液丹參酮ⅡA(100 ng·mL-1，甲醇) 50 μL，渦混1 min，再加入甲醇150 μL，渦混2 min，4 ℃ 25 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)樣，UPLC-MS分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性考察 取大鼠空白血漿，分別精密量50 μL，6份，按照2.3.1項(xiàng)下方法操作，經(jīng)UPLC-MS/MS分析，得空白樣品色譜圖。將一定濃度的絞股藍(lán)皂苷A對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，37 ℃氮?dú)獯蹈珊?，加入空白血漿渦旋混勻，依法操作，得相應(yīng)色譜圖。通過比較可以判斷大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)是否干擾待測物的測定。

2.4.2線性關(guān)系、檢測限與定量限 精密移取各系列絞股藍(lán)皂苷A對(duì)照品溶液各50 μL，37 ℃ 氮?dú)獯蹈珊螅尤?0 μL大鼠空白血漿，渦旋混勻，得絞股藍(lán)皂苷A系列對(duì)照品溶液(10、20、50、100、200、400、500 ng·mL-1)，其余按2.3.2項(xiàng)下方法操作。以絞股藍(lán)皂苷A血藥濃度為橫坐標(biāo)(C)，絞股藍(lán)皂苷A與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，以加權(quán)系數(shù)1/C2進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.3準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn) 按2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍項(xiàng)下方法分別配制高、中、低濃度(20、100、400 ng·mL-1)的質(zhì)控樣品，同法配制與定量下限(LLOQ)質(zhì)量濃度(10 ng·mL-1)相當(dāng)?shù)馁|(zhì)控(QC)樣品，每個(gè)濃度平行分析5次，連續(xù)測定3 d，求得方法的日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度。

準(zhǔn)確度=(實(shí)測濃度/標(biāo)示濃度)×100%

(1)

2.4.4提取回收率試驗(yàn) 分別取空白血漿50 μL，配制20、100、400 ng·mL-13個(gè)質(zhì)量濃度QC樣品，每個(gè)濃度平行配制6份，按2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍項(xiàng)下操作方法處理，取5 μL進(jìn)樣，UPLC-MS分析，得絞股藍(lán)皂苷A峰面積A1和內(nèi)標(biāo)峰面積A2。

另取空白血漿50 μL，置1.5 mL 塑料離心管中，加入甲醇200 μL，渦混2 min，4 ℃ 25 000 r·min-1離心10 min，得空白血清上清液。取沉淀蛋白后的空白血漿上清液，配制20、100、400 ng·mL-13個(gè)質(zhì)量濃度QC樣品，再分別加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合1 min，25 000 r·min-1(離心半徑為5.35 cm)離心10 min，取上清液5 μL進(jìn)樣，UPLC-MS分析，得絞股藍(lán)皂苷A峰面積B1和內(nèi)標(biāo)峰面積B2。

絞股藍(lán)皂苷A的提取回收率=A1/B1×100%

(2)

內(nèi)標(biāo)的提取回收率=A2/B2×100%

(3)

2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白血漿50 μL，配制20、100、400 ng·mL-13個(gè)質(zhì)量濃度QC樣品，每個(gè)濃度配制6份溶液，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

考察條件：QC樣品在室溫下放置8 h；QC樣品在-80 ℃下凍存2個(gè)月；QC樣品在3個(gè)凍-融循環(huán)；按2.3.2項(xiàng)下方法處理后的3種質(zhì)量濃度的QC樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器(10 ℃)下放置12 h；儲(chǔ)備液在-20 ℃下放置30 d。計(jì)算絞股藍(lán)皂苷A在不同穩(wěn)定性考察條件下的偏差，若偏差在±15%以下，則認(rèn)為樣品穩(wěn)定[5]。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6份空白血漿樣品(來源于6只大鼠)各50 μL，置1.5 mL 塑料離心管中，加入甲醇200 μL，渦混2 min，4 ℃ 25 000 r·min-1(離心半徑為5.35 cm)離心10 min，得空白血清上清液。取沉淀蛋白后的空白血漿上清液，配制20、100、400 ng·mL-13個(gè)質(zhì)量濃度QC樣品，每個(gè)濃度平行配制6份，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦混1 min，4 ℃，25 000 r·min-1(離心半徑為5.35 cm)離心10 min，吸取上清液5 μL，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，得到絞股藍(lán)皂苷A峰面積C1和內(nèi)標(biāo)峰面積C2。

取質(zhì)量濃度為4、20、80 ng·mL-1的絞股藍(lán)皂苷A溶液和20 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，各取5 μL，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，得到絞股藍(lán)皂苷A峰面積D1和內(nèi)標(biāo)的峰面積D2。

絞股藍(lán)皂苷A的基質(zhì)效應(yīng)= C1/D1×100%

(4)

內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)=C2/D2×100%

(5)

若結(jié)果在85. 0%～115.%，則認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DAS 3. 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析時(shí)用非房室模型進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 定量離子對(duì)的選擇

對(duì)絞股藍(lán)皂苷A和內(nèi)標(biāo)丹參酮ⅡA進(jìn)行全掃描分析。正離子下，絞股藍(lán)皂苷A能夠產(chǎn)生m/z899.35[M+H]+，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片為m/z814.47。因此，選擇m/z899.35～814.47為絞股藍(lán)皂苷A的定量離子對(duì)。同樣選擇m/z295.1～206.03作為丹參酮ⅡA的定量離子對(duì)。

3.2 血漿樣品處理方法

比較了幾種常規(guī)的血漿樣品處理方法，其中固相萃取法，可以除掉大部分干擾物質(zhì)，但價(jià)格較為昂貴；沉淀蛋白法，操作簡單，重復(fù)性好，成本最低。所以，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇了沉淀蛋白法作為本研究中的血漿樣品的處理方法[6]。

3.3 分析方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 在本研究優(yōu)化后的色譜條件下，空白血漿色譜圖、空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖和給藥后血漿色譜圖分別見圖2。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾絞股藍(lán)皂苷A和內(nèi)標(biāo)的測定。

注：A.空白血漿；B.含絞股藍(lán)皂苷A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的空白血漿；C.給藥1 h后血漿樣品中的絞股藍(lán)皂苷A；D.空白血漿；E.含有內(nèi)標(biāo)丹參素ⅡA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的空白血漿；F.給藥1 h后血漿樣品中的內(nèi)標(biāo)丹參素ⅡA。圖2 絞股藍(lán)皂苷A和內(nèi)標(biāo)丹參素ⅡA的血漿樣品典型色譜圖

3.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量限 以絞股藍(lán)皂苷A血藥濃度為橫坐標(biāo)，絞股藍(lán)皂苷A與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，以加權(quán)系數(shù)1/C2進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 6X+0.003 2 (r=0.998 4)。結(jié)果表明，血漿中絞股藍(lán)皂苷A在10～500 ng·mL-1線性關(guān)系良好。方法最低定量限(LLOQ)為10 ng·mL-1(S/N>10)，表明該方法靈敏度較高，可用于絞股藍(lán)皂苷A的定量分析。

3.3.3準(zhǔn)確度和精密度 準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果見表1，結(jié)果表明，準(zhǔn)確度為 97.0%～98.5%，日內(nèi)精密度RSD<7%，日間精密度RSD<4%。

表1 大鼠血漿中絞股藍(lán)皂苷A UPLC-MS/MS測定的準(zhǔn)確度和精密度(n=5)

3.3.4基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 提取回收率結(jié)果見表2，結(jié)果表明，3個(gè)濃度提取回收率為84.7%～86.4%，符合生物樣本的分析要求，且RSD<4%。基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果表明，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾絞股藍(lán)皂苷A的測定，且RSD<5%。

表2 絞股藍(lán)皂苷A和內(nèi)標(biāo)在大鼠血漿中提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察(n=6)

3.3.5樣本穩(wěn)定性 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷A在血漿中-80 ℃下凍存2個(gè)月、-20 ℃下放置30 d、室溫下放置8 h、在自動(dòng)進(jìn)樣器(10 ℃)下放置12 h、經(jīng)過3個(gè)凍-融循環(huán)后基本穩(wěn)定，不同穩(wěn)定性考察條件下的偏差均在±15%以下，穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表3。

表3 絞股藍(lán)皂苷A在大鼠血漿中不同條件下的穩(wěn)定性考察(n=6)

結(jié)果表明，本研究所建立的大鼠血漿樣品分析方法符合藥動(dòng)學(xué)研究的相關(guān)要求，可以用于絞股藍(lán)皂苷A的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。

3.4 藥動(dòng)學(xué)研究

大鼠口服給予葛蘭心寧軟膠囊后，絞股藍(lán)皂苷A的體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。

圖3 大鼠口服給予葛蘭心寧軟膠囊后絞股藍(lán)皂苷A的藥時(shí)曲線動(dòng)物數(shù)=12)

葛蘭心寧軟膠囊口服后其主要藥效成分絞股藍(lán)皂苷A能夠迅速吸收進(jìn)入血液中，給藥后15 min在血中可以檢測到絞股藍(lán)皂苷A，并于0.75 h迅速達(dá)到最大血藥濃度，消除相對(duì)較快，半衰期為(6.247±2.039)h。非房室模型分析所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。

表4 大鼠口服給予葛蘭心寧軟膠囊后絞股藍(lán)皂苷A的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4 結(jié)論

本研究建立了大鼠灌胃葛蘭心寧軟膠囊內(nèi)容物后，血漿中絞股藍(lán)皂苷A的 LC-MS/MS 測定方法，并采用非房室模型計(jì)算分析了其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。該方法簡單、快捷、靈敏度高、精密度及線性關(guān)系良好，可以用于生物樣本中絞股藍(lán)皂苷A的藥代動(dòng)力學(xué)研究。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax反映了藥物在血漿中的最大濃度，絞股藍(lán)皂苷A的Cmax為(377.6±75.3)μg·L-1，0.75 h迅速達(dá)到最大血藥濃度，t112為(6.247±2.039)h，CL為(0.249 2±0.050 02)L·h-1·kg-1，清除非常快。絞股藍(lán)皂苷 A 是絞股藍(lán)中含量較高且有效的單體成分[3]，其結(jié)構(gòu)屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷。Zhang等[7]報(bào)道了大鼠口服絞股藍(lán)總皂苷后，2個(gè)達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷類成分gypenoside LⅥ和gypenoside ⅩLⅥ的藥代動(dòng)力參數(shù)，半衰期與本研究的結(jié)果相近，但是Tmax為4 h，可能與糖基的種類、數(shù)量、連接位置不同有關(guān)。