程顯隆，李明華a，郭曉晗，林永強，魏鋒*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.山東省食品藥品檢測研究院，山東 濟南 250101

中藥質(zhì)量控制是中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的保障。建立能有效控制中藥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是中藥檢驗工作者一直努力的方向。中藥的藥效是多種成分的協(xié)同作用的結(jié)果，因此，有學(xué)者提出，需對全成分進行檢測分析，達到質(zhì)量控制的目的。諸如特征圖譜，一標(biāo)多測等方法即是這種思路的體現(xiàn)。另有學(xué)者提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念，希望從本質(zhì)上解決中藥的質(zhì)量問題。這些觀點對于中藥質(zhì)量的提升起到很好的促進作用。無論何種觀點，能解決質(zhì)量問題才是根本。中藥品種繁多，每個品種的質(zhì)量問題不一樣，并且質(zhì)量問題也是一個動態(tài)發(fā)展的過程，不同歷史時期，同一品種會有不同的質(zhì)量問題。因此，需要對每個品種的質(zhì)量問題進行分析，并針對質(zhì)量問題找出合理的質(zhì)量控制指標(biāo)，達到解決質(zhì)量問題才是中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵。本文針對膠類藥材的質(zhì)量問題，找出能體現(xiàn)質(zhì)量本質(zhì)的特征多肽為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 存在問題

膠類藥材是指由特定動物的皮、角、甲殼等加工而成的膠原蛋白，是我國特有的一類動物來源中藥，臨床常用的有龜甲膠、鹿角膠、阿膠等。不同膠類藥材，因其動物來源及成分不同，在中醫(yī)臨床上的功能主治也有所差別。

由于動物膠類藥材的生產(chǎn)原料短缺，價格昂貴，導(dǎo)致該類藥材摻偽、造假情況非常嚴(yán)重。部分生產(chǎn)企業(yè)并非用真正龜甲、鹿角，而是以雜皮如牛皮、驢皮等投料。更有甚者，以腐爛變質(zhì)的雜皮或工業(yè)皮革下腳料投料生產(chǎn)。2010年6月，中央電視臺質(zhì)量調(diào)查欄目曝光了國內(nèi)市場上膠類藥材存在的嚴(yán)重質(zhì)量問題，在社會上引起了極大的反響。在2015年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)出版以前，膠類藥品標(biāo)準(zhǔn)中收載的檢測項目和方法專屬性不強，均無法鑒別膠類藥材的來源。動物藥所含的成分主要為蛋白質(zhì)類生物大分子，長期以來，由于基礎(chǔ)研究薄弱及分析技術(shù)所限，動物藥的分析檢測難度極大，導(dǎo)致動物藥至今沒有專屬性較強的檢測方法，相關(guān)藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及控制水平仍然很低。

針對膠類藥材的質(zhì)量控制方法，已有許多學(xué)者作過多方面的研究。圍繞著膠類藥材的主要成分膠原蛋白，采用多種方法進行探索，如差示掃描量熱法、凝膠電泳法、二維相關(guān)紅外光譜法、運動黏度法、圓二色性分析法及氨基酸分析法等[1-2]。這些方法都是蛋白質(zhì)類成分的通用檢測方法，專屬性不強，達不到物種鑒定的目的。另外上述方法只是對正品和純偽品的鑒別，而對于正品中摻加部分偽品(雜皮)的問題無能為力。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為一種分子生物學(xué)技術(shù)，可指數(shù)級擴增特定的DNA片段，具有特異性強、靈敏度高等特點，但用在膠類藥材的鑒別研究中，發(fā)現(xiàn)由于受熬膠時高溫破壞，特定的DNA片段殘存量極低，提取較困難，加上基質(zhì)復(fù)雜，干擾大，經(jīng)常有假陽性或假陰性的結(jié)果，或者結(jié)果的重復(fù)性不理想，導(dǎo)致該法至今沒有應(yīng)用到膠類藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

綜上所述，膠類藥材目前普遍存在的問題是專屬性成分未明確、檢測方法專屬性不強、質(zhì)量難以評價等。因此，找出各個膠類藥材物種間的專屬性成分，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對于合理評價龜甲膠、鹿角膠的質(zhì)量，對保障人民用藥安全、進行藥品監(jiān)管具有重要意義。

2 研究思路

膠類的主要成分是膠原蛋白，對膠原蛋白進行分析，是研究質(zhì)量控制方法的重點?？紤]到不同的動物，其DNA是不同的，由DNA指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)序列必然存在差異性因此，本研究的關(guān)鍵是找出對物種鑒定有貢獻的特征肽段。特征肽的尋找一般有2種方法：一種是對于已知的膠原蛋白理論序列的，可以將不同動物蛋白質(zhì)理論序列進行比對，找出有序列差異的肽段，設(shè)定為目標(biāo)離子，采用液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)進行分析，建立檢測方法[3]；另一種方法是對于未知膠原蛋白序列的，將不同膠類藥材分別采用胰蛋白酶酶切，生成多個肽段的混合物，采用LC-MS進行分析，得到肽圖。對肽圖進行主成分分析和偏最小二乘法分析，找出差異性的肽段作為目標(biāo)離子，建立檢測方法[4-7]。

3 研究工作關(guān)鍵點

3.1 肽圖的建立

采用胰蛋白酶對膠原蛋白進行酶解。采用LC-MS對酶解肽進行分析，得到LC-MS肽圖。采用胰蛋白酶進行酶解，主要目的是：1)鑒于膠原蛋白的同源性，不同動物的膠原蛋白氨基酸序列具有很大的相似性。這種有序列差異的肽段在整個膠原蛋白序列中占的比例比較小。需要用胰蛋白酶將這些比較較小的差異肽段酶切出來，突出差異性。2)同時考慮到大分子成分不易在C18色譜柱上分型，將相對分子質(zhì)量較大的膠原蛋白酶切成相對分子質(zhì)量較小的肽段，可以采用C18色譜柱進行分析。

3.2 尋找特征肽段

由于在各肽類樣品的LC-MS肽圖中，成分復(fù)雜，數(shù)據(jù)信息量較大，達到幾千個數(shù)據(jù)點。無法直觀的判斷出各個膠類的差異。需要借助數(shù)學(xué)統(tǒng)計分析軟件對LC-MS數(shù)據(jù)進行差異分析[8-11]。本實驗中，將阿膠、鹿角膠、龜甲膠、黃明膠、新阿膠5種膠進行主成分分析(PCA)分析，5種膠類分別落在不同的區(qū)域。說明各個膠類之間是有明顯差異。為進一步鑒定各個膠類的差異性成分，利用無監(jiān)督統(tǒng)計學(xué)模型，結(jié)合正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)進行二維數(shù)據(jù)分析。最終找出各個膠類的特征離子，5種膠類的離子匯總見表1。

表1 各個膠類中的特征離子

4 膠類標(biāo)準(zhǔn)制修訂概述

上述離子的特征性只是體現(xiàn)在可以用以區(qū)分這5種膠類，是相對專屬的，而不是絕對專屬的。如果增加膠原蛋白序列比對動物的種類，可能這些膠類的特征離子也會變得不具有特征性。但這些相對專屬的特征離子已經(jīng)能夠解決目前膠類摻偽造假的質(zhì)量問題。以這些離子為指標(biāo)成分，開展了膠類藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項目以及補充檢驗方法研究。

在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項中，主要是2015年版《中國藥典》收載的阿膠、鹿角膠、龜甲膠的LC-MS特征肽鑒別項。鑒別項是對正品應(yīng)當(dāng)具有的性質(zhì)的一種描述。在這3個鑒別項中要求必須相應(yīng)的檢出驢皮、鹿角、龜甲的特征離子。

另外，針對摻偽、造假的問題。還建立了一些雜皮檢查項補充檢驗方法。補充檢驗方法是藥品監(jiān)管部門打擊摻偽造假的有利武器。2002年9月15日施行的《藥品管理法實施條例》(以下簡稱《條例》)第五十八條規(guī)定：“對有摻雜、摻假嫌疑的藥品，在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗方法和檢驗項目不能檢驗時，藥品檢驗機構(gòu)可以補充檢驗方法和檢驗項目進行藥品檢驗；經(jīng)國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)后，使用補充檢驗方法和檢驗項目所得出的檢驗結(jié)果，可以作為藥品監(jiān)督管理部門認定藥品質(zhì)量的依據(jù)。”這是國家對于藥品監(jiān)管部門提出的具體要求，也是國家藥監(jiān)部門發(fā)布“補充檢驗方法”的法律依據(jù)。

自《條例》發(fā)布以來，國家藥監(jiān)部門發(fā)布的藥品補充檢驗方法很多。大多數(shù)補充檢驗方法是基于打假需要而訂立。而且必須要在市場上出現(xiàn)了某一造假行為，才能發(fā)布相應(yīng)的補充檢驗方法。因此，關(guān)于膠類中摻加雜皮的不同補充檢驗方法，不是一次性同時發(fā)布的，而是在不同時期，根據(jù)市場上的摻加行為及相應(yīng)摻偽產(chǎn)品，開展方法學(xué)研究，依次發(fā)布的。早在1996年，中央電視臺就曾曝光過假阿膠事件。時隔多年之后，阿膠造假不僅沒有得到遏制，而且越演越烈。2010年6月6日中央電視臺再度曝光，不法廠家竟然用混了牛皮的下腳料做原料來制阿膠，給使用皮革下腳料的阿膠產(chǎn)品消費者的健康帶來威脅。針對牛皮摻偽的情況，國家藥監(jiān)部門開展阿膠專項抽驗工作，中國食品藥品檢定研究院承擔(dān)了這項工作，并開展性相應(yīng)檢測方法的研究，并于2012年4月23日發(fā)布了阿膠中牛皮源成分檢查項補充檢驗方法。這個補充檢驗方法的發(fā)布，讓阿膠摻加牛皮的行為得到遏制。隨后，國家藥監(jiān)部門在2014年多次接到某些企業(yè)的鹿角膠、龜甲膠中存在摻加阿膠和牛皮的不法行為，針對這種行為，國家局在開展飛行檢查的同時，于2014年7月17日又發(fā)布了鹿角膠、龜甲膠中驢皮源和牛皮源成分檢查項補充檢驗方法2項，有效打擊了鹿角膠、龜甲膠中摻加阿膠和牛皮的情況。在2016年以后，國家藥品監(jiān)管部門又陸續(xù)開展了膠類專項檢查、飛行檢查等工作，針對阿膠、鹿角膠、龜甲膠中摻加豬皮源成分的不法行為，于2019年7月17日發(fā)布了阿膠、鹿角膠、龜甲膠中豬皮源成分檢查項補充檢驗方法3項。從上述補充檢驗方法的發(fā)布來看，膠類的質(zhì)量問題是一個動態(tài)發(fā)展的過程，隨著新的質(zhì)量問題不斷發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)也在不斷的完善。

在發(fā)布的這些補充檢驗方法中沒有規(guī)定不得檢出雜皮源成分，而是規(guī)定了一個檢出限度。這種規(guī)定也符合中藥的特點。自然產(chǎn)出的中藥不可能像人工合成的化學(xué)藥那樣達到很高的純度。其原料在采集、采收的過程中，不可避免地引入雜質(zhì)，這在歷版《中國藥典》中也有所體現(xiàn)。在2015年版《中國藥典》通則0212藥材和飲片檢定通則中規(guī)定了藥屑雜質(zhì)通常不得過3%。另外，“未檢出”和“檢出”是相對的，當(dāng)某一雜皮含量很低的樣品時，在靈敏度低的儀器上，給出的是未檢出雜皮的結(jié)果，但用靈敏度高的儀器檢測時，可能會給出檢出雜皮的結(jié)果。因此，檢測儀器靈敏度存在差異的情況下，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定一個檢出限度就顯得更合理。結(jié)合市場調(diào)研和檢測方法的準(zhǔn)確性等方面，規(guī)定了雜皮不得超過5%，對于雜皮未超過5%限度的樣品，都視為合格產(chǎn)品。

膠類中的補充檢驗方法在陸續(xù)發(fā)布以后，對于每個膠類來說，多個補充檢驗方法并存，大大提高了檢測的成本。基于減少檢測成本的考慮，在這些方法的研究過程中，均采用了相同的樣品處理方法、色譜條件和質(zhì)譜條件，每個質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或補充檢驗方法，僅僅是檢測的目標(biāo)離子不同。這樣，在實際檢測中，就可以在相同的檢測條件下，同時按多個補充檢驗方法進行檢測。

5 總結(jié)與思考

從膠類藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究來看，標(biāo)準(zhǔn)的制定要能夠有針對性地解決實際的質(zhì)量問題。并且標(biāo)準(zhǔn)的研究建立，是針對不同時期的質(zhì)量問題，不斷完善的過程，是動態(tài)的過程。標(biāo)準(zhǔn)研究的過程中需要深入基礎(chǔ)研究，在標(biāo)準(zhǔn)建立發(fā)布的過程中，需要考慮到簡單、經(jīng)濟的原則。

膠類藥材的研究成果已多次應(yīng)用于國家局組織的飛行檢查、“兩打兩建”和阿膠、龜甲膠、鹿角膠專項抽驗等工作中，在檢驗實踐中起到積極打擊摻偽造假的作用，給膠類造假的不法企業(yè)很大的威懾。但同時，不法分子可能會用新的雜皮摻入到膠類藥材中，規(guī)避已經(jīng)發(fā)布的補充檢驗方法。針對新的質(zhì)量問題，藥監(jiān)部門又需要繼續(xù)建立新的補充檢驗方法來打擊新的不法行為，可以說是打假道路無止境。