劉亞江， 馮金華，鄒瓊燕，黃文超，李佳艷

作者單位： 423000 湖南省郴州市第一人民醫(yī)院醫(yī)療集團(tuán)南院腫瘤ICU(劉亞江、黃文超、李佳艷)，健康管理中心(馮金華)；410011 長(zhǎng)沙，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院甲乳外科(鄒瓊燕)

乳腺癌是女性易患的惡性腫瘤之一，不同國(guó)家乳腺癌患病人數(shù)也不相同，我國(guó)乳腺癌患者年齡逐漸下降，比其他國(guó)家女性早10～15年[1]。中國(guó)屬于發(fā)病率較低的國(guó)家，但是，近年來的增長(zhǎng)速度卻持續(xù)升高[2]。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)東部城市的女性發(fā)病人數(shù)明顯多于其他地區(qū)[3]。乳腺癌的病因相當(dāng)復(fù)雜，該病的發(fā)生與遺傳、環(huán)境等多種原因有關(guān)[4]，已引起臨床及科研人員高度關(guān)注，正逐步加深治療乳腺癌的相關(guān)研究。雖然手術(shù)治療及術(shù)后的化、放療發(fā)展迅速，對(duì)乳腺癌患者作用明顯，但仍不能阻礙癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。乳腺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)嚴(yán)重延緩了患者的康復(fù)時(shí)間，給治療增加了很多困難。因此，尋求綜合、有效的治療方案是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[6]。黃連素是黃連抗菌的主要成分，該藥物對(duì)臨床常見疾病有一定治療效果[7-8]。實(shí)驗(yàn)研究顯示，黃連素對(duì)常見癌癥存在一定抑制作用，但黃連素在乳腺癌中的作用及相關(guān)機(jī)制仍不清楚[9]。因此，現(xiàn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株(T47D細(xì)胞)凋亡、增殖、侵襲、遷移情況進(jìn)行研究，并觀察不同濃度黃連素對(duì)T47D細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)T47D細(xì)胞：在ATCC細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買乳腺癌細(xì)胞株(T47D細(xì)胞)，隨機(jī)分為3組，乳腺癌組(BC組)單純T47D細(xì)胞不做其他處理，正常培養(yǎng)；低濃度組(LC組)將T47D細(xì)胞與10 μmol/L黃連素溶液混合培養(yǎng)；高濃度組(HC組)將T47D細(xì)胞與30 μmol/L黃連素溶液混合培養(yǎng)。(2)試藥試劑：黃連素(上海曙燦實(shí)業(yè)公司)，胎牛血清CCK-8 試劑盒(北京杰輝博高生物公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(紹興市精源儀化貿(mào)易中心)。(3)儀器：恒溫?fù)u床(成都蘇凈器材公司，型號(hào) CHA-S型)，離心機(jī)(上海繼譜電子科技有限公司，型號(hào) LGZ800)，熒光顯微鏡(上海萬(wàn)衡精密儀器有限公司，型號(hào) XSP-BM22AY)，讀板器(深圳瑪雅電玩科技有限公司，型號(hào) VL0000D0)，Transwell小室(武漢弗凡科技有限責(zé)任公司,型號(hào)PIHT12R48)，Guava流式細(xì)胞儀(南京兆坤儀器有限公司，型號(hào)Guava)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 2019年2—8月在郴州市第一人民醫(yī)院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將T47D細(xì)胞在含有胎牛血清的DMEM培育液中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化、離心、收集、重懸并培養(yǎng)T47D細(xì)胞。LC組、HC組分別將T47D細(xì)胞與10 μmol/L、30 μmol/L的黃連素溶液混合培養(yǎng)，48 h后用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 TUNEL檢測(cè)T47D細(xì)胞凋亡：將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，在6孔板中種入T47D細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使T47D細(xì)胞生長(zhǎng)占70%～80%培養(yǎng)皿，進(jìn)行TUNEL染色，然后用20 μg/ml蛋白酶K孵育，用TdT/dUTP反應(yīng)混合物在37℃孵育1 h進(jìn)行DNA片段標(biāo)記，然后使用PBS洗3次，用含有5%正常山羊血清的封閉緩沖液封閉1 h，將切片在封閉緩沖液中與兔抗大鼠SP1抗體(1∶1 000)一起孵育1 h，在避光、室溫條件下孵二抗(1∶200)40 min，進(jìn)一步?jīng)_洗后，用蓋玻片覆蓋切片，切片中加Vectashield Hard Set 封固涂片樣本，標(biāo)記反應(yīng)，于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)T47D細(xì)胞凋亡：增加培養(yǎng)液調(diào)整T47D細(xì)胞密度為1.2×106/L，接種于6孔板中，處理12 h,培養(yǎng)箱中孵育24 h，采用不含EDTA的消化液消化，1 000 r/min離心5 min并收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，棄去上清液，各組分別加入400 μl預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液，分別加入5 μl Annexin V-FITC和LPI溶液，混勻細(xì)胞，避光孵育15 min后，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。采用FC500流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)T47D細(xì)胞增殖： 取出轉(zhuǎn)染后的T47D細(xì)胞，稀釋為1×105/ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出，取培養(yǎng)好的T47D細(xì)胞平鋪到16孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞增長(zhǎng)至一定數(shù)量后，加入CCK-8試劑10 μl。37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)=450 nm)下檢測(cè)各孔吸光度 A 值(A=各孔的OD值-調(diào)零孔的OD值 )。

1.3.4 細(xì)胞劃痕法測(cè)定T47D細(xì)胞的遷移能力： 取一瓶長(zhǎng)滿的以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的T47D細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基終止消化后，將細(xì)胞懸液移至15 ml離心管中離心，速度1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基5 ml，用1 ml移液槍充分吹打完全后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天進(jìn)行模擬罐法負(fù)壓干預(yù)，在長(zhǎng)滿單層T47D細(xì)胞的情況下用細(xì)胞刮刀垂直培養(yǎng)袋底劃痕(細(xì)胞刮刀的劃痕寬度為0.5 mm)，用PBS洗細(xì)胞3次，洗去劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基并放入模擬罐法負(fù)壓裝置中，之后移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)、24 h后拍照(記為24 h)。

1.3.5 Transwell 檢測(cè)T47D細(xì)胞侵襲： 取出轉(zhuǎn)染后的T47D細(xì)胞，稀釋為1×105/ml，在血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。準(zhǔn)備Transwell小室，上室鋪ECM膠，下室加500 μl含10%血清培養(yǎng)基，靜置4 h，吸出液體，殘留液風(fēng)干。取200 μl培養(yǎng)好的細(xì)胞接種在遷移室中,24 h后，取出細(xì)胞，乙醇固定，結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 各組TUNEL法檢測(cè)T47D細(xì)胞凋亡數(shù)量比較 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，BC組T47D細(xì)胞凋亡數(shù)量最少，HC組細(xì)胞凋亡數(shù)量最多，BC組細(xì)胞凋亡數(shù)低于LC組(t=7.111,P<0.01)，LC組凋亡數(shù)低于HC組(t=16.852，P<0.01)，3組細(xì)胞凋亡數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=336.254，P<0.01)，見圖1。

2.2 各組流式細(xì)胞儀檢測(cè)T47D細(xì)胞調(diào)亡率比較 HC組T47D細(xì)胞凋亡數(shù)量最多，凋亡率為(61.35±6.38)%，LC組為(26.97±3.75)%，BC組為(16.57±2.53)%。BC組細(xì)胞凋亡率低于LC組(t=7.275,P<0.01)，LC組凋亡率低于HC組(t=14.697，P<0.01)，3組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=264.600，P<0.01)，見圖2。

2.3 各組CCK-8法檢測(cè)T47D細(xì)胞增殖比較 T47D細(xì)胞的增殖數(shù)量以O(shè)D值表示，HC組(0.45±0.06)低于LC組(0.72±0.08)(t=8.538，P<0.01)低于BC組(1.12±0.10)(t=9.877，P<0.01),3組細(xì)胞增殖數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=170.582，P<0.01)。

2.4 各組細(xì)胞劃痕法檢測(cè)T47D細(xì)胞遷移能力比較 0 h時(shí)3組T47D細(xì)胞均無遷移，24 h時(shí)HC組T47D細(xì)胞遷移面積最小為(358.4±37.5)pixel2，無細(xì)胞區(qū)域?qū)挾茸畲?；LC組T47D細(xì)胞遷移面積(474.9±46.8)pixel2顯著高于HC組細(xì)胞(t=6.143，P<0.01)，BC組T47D細(xì)胞遷移面積(543.6±55.7)pixel2顯著高于LC組細(xì)胞(t=2.986，P=0.007)，3組細(xì)胞遷移面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.25，P<0.01)，見圖3。

2.5 各組Transwell法檢測(cè)T47D細(xì)胞侵襲能力比較 HC組T47D細(xì)胞侵襲能力較差，顯微鏡下細(xì)胞侵襲數(shù)量為(11.22±0.84)個(gè)；LC組T47D細(xì)胞侵襲數(shù)量為(25.36±1.41)個(gè)；BC組T47D細(xì)胞侵襲數(shù)量為(46.75±3.18)個(gè)，HC組細(xì)胞侵襲數(shù)量少于LC組(t=27.246，P<0.01)，BC組細(xì)胞侵襲數(shù)量高于LC組(t=19.453,P<0.01)，3組細(xì)胞侵襲能力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=754.263，P<0.01)，見圖4。

3 討 論

乳腺癌發(fā)病率已位居?jì)D科癌癥首位。近年來，我國(guó)在治療乳腺癌方面獲得了較多的成就，手術(shù)、化療、內(nèi)分泌及靶向治療方式，在減輕患者痛苦的基礎(chǔ)上，也提高了部分患者5～10年生存率，但癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況時(shí)有發(fā)生，發(fā)生率也同樣居高不下[10]。隨著臨床工作者的不斷探索，除常規(guī)手術(shù)之外的多種治療手段也得到了應(yīng)用，但早期乳腺癌的治療方法仍局限于手術(shù)治療，放療加化療的手術(shù)患者生存率也開始小幅度提升[11]，但治愈率仍較低，因此，急需尋找更好的藥物來治療乳腺癌。研究顯示，黃連素具有氮三角的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在治療臨床常見疾病中有較顯著的效果[12]。近年來發(fā)現(xiàn)，黃連素的藥理作用在治療癌癥方面也較為顯著，同時(shí)，黃連素具有高安全性、有效性和低成本的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于臨床中癌癥的治療[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，顯著增加癌細(xì)胞中黃連素的含量能抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育與黃連素有密切關(guān)系，并在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的過程中占主導(dǎo)地位[14-15]。本研究表明，BC組T47D細(xì)胞凋亡率最少，HC組T47D細(xì)胞凋亡率最多，HC組T47D細(xì)胞凋亡率顯著多于LC組，LC組T47D細(xì)胞凋亡率顯著多于BC組。HC組細(xì)胞增殖OD值顯著低于LC組，LC組T47D細(xì)胞的增殖OD顯著低于BC組。HC組T47D細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)量顯著低于LC組，LC組T47D細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)量顯著低于BC組。大量研究發(fā)現(xiàn)，黃連素在食管癌的發(fā)展過程中有抑制癌細(xì)胞的作用，其高表達(dá)還能抑制卵巢癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力。黃連素在治療人體多種系統(tǒng)和器官惡性腫瘤中效果顯著，高濃度黃連素可抑制食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，發(fā)揮抑癌基因的作用[16-17]。研究表明，增加細(xì)胞中黃連素的含量能顯著影響細(xì)胞的活性，與癌細(xì)胞的惡性度關(guān)系顯著，能使其惡性度顯著下降，這與宮頸癌的治療率及復(fù)發(fā)率有顯著關(guān)系，說明在宮頸癌的發(fā)展過程中，黃連素的用藥濃度占關(guān)鍵作用[18]。報(bào)道顯示，在卵巢癌細(xì)胞中黃連素高表達(dá)能減緩癌細(xì)胞的擴(kuò)散、增殖，且黃連素濃度與抑癌作用呈顯著相關(guān)性，即黃連素濃度越高，抑制作用越明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)量越多[19-20]。以上多種研究表明，黃連素能夠抑制多種臨床常見腫瘤，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，提高患者生存質(zhì)量，可以通過調(diào)節(jié)黃連素在癌細(xì)胞中的表達(dá)含量來達(dá)到治療癌癥的目的，為乳腺癌的診斷和治療發(fā)展新方向。

綜上所述，黃連素對(duì)T47D細(xì)胞的生長(zhǎng)存在抑制作用，且與黃連素的濃度呈正相關(guān)，即濃度越高，抑制效果越明顯。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉亞江、馮金華：提出選題及研究方向，設(shè)計(jì)研究方案，獲取數(shù)據(jù)，實(shí)施研究過程，論文撰寫；鄒瓊燕、黃文超：補(bǔ)充研究方向，分析研究數(shù)據(jù)，修改論文；李佳艷：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，補(bǔ)充數(shù)據(jù)，論文終審