周俏苗，汪洪林，岑慧，肖美芳，黃海燕，許晶，施蕾

子癇前期(preeclampsia，PE)是臨床常見的一種妊娠期并發(fā)癥，通常發(fā)生在妊娠20～34周期間[1]。PE患者臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿、高血壓及水腫，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致昏迷、抽搐及心、腎功能衰竭等癥狀，并可伴隨早產(chǎn)，不僅對(duì)孕婦本身的身體健康帶來影響，還會(huì)影響胎兒的生命健康，嚴(yán)重時(shí)需要采取人工流產(chǎn)的方式來終止妊娠[2-3]。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA[4]，目前不少研究表明，miRNA與PE的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系，而miRNA-26a-5p和miRNA-135a-5p在子癇前期發(fā)生中的研究少見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過分析PE孕婦血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)情況，以期為深入研究PE的發(fā)生機(jī)制提供新的思路，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年7月—2019年8月海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科收治的手術(shù)分娩PE孕婦30例為觀察組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合PE 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)均為單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期糖尿病者；(2)原發(fā)性高血壓病者；(3)其他妊娠期并發(fā)癥者。選擇同期孕周匹配的正常手術(shù)分娩孕婦30 例為對(duì)照組。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 2組基線資料比較

1.2 試劑與儀器 (1)試劑：DNA提取試劑盒由美國(guó)Promega公司提供，測(cè)序反應(yīng)試劑由美國(guó)ABI公司提供，PCR反應(yīng)試劑盒由美國(guó)Invitrogen公司提供，引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司提供。 (2)儀器：切片機(jī)(型號(hào)：OPJ-1B，天津天利航空機(jī)電有限公司)、離心機(jī)(型號(hào)：5424r，美國(guó)Eppendorf 公司)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào)：DG3022，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn))、PCR擴(kuò)增儀(型號(hào)：S100，美國(guó)Bio-Rad公司)、顯微鏡(型號(hào)：Olympus IX71，日本OLYMPUS)、電泳儀(型號(hào)：Bio-RaD，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 樣本采集：采集研究對(duì)象入院當(dāng)天外周靜脈血(禁食8 h)5 ml，20℃下靜置30 min后，離心機(jī)3 000 rpm離心10 min，取上清，置入-80℃冰箱備存。剖宮產(chǎn)胎盤娩出后5 min內(nèi)，取胎盤組織，剪取中央部位組織塊(1 cm×1 cm×1 cm)，無菌生理鹽水漂洗，裝入EP管并置入-80℃冰箱備存。

1.3.2 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p的表達(dá)：取出血清解凍，按照Trizol試劑的說明書提取組織總RNA(純度比值范圍控制：1.8～2.0)，標(biāo)記miRNA，進(jìn)行miRNA芯片雜交，并掃描及數(shù)據(jù)分析。選取miRNA芯片結(jié)果中的miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p進(jìn)行熒光定量PCR分析，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒配置反應(yīng)混合物，反轉(zhuǎn)錄合成環(huán)狀DNA，RT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性3 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)，相關(guān)引物序列由上海生工公司提供(見表2)，每個(gè)樣品目的基因的CT值用內(nèi)參基因(U6RNA)來進(jìn)行歸一化，獲得實(shí)驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品的△CT值，目的基因相對(duì)U6的表達(dá)量=2-△CT，最后計(jì)算miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p相對(duì)表達(dá)量2-△△CT。

表2 相關(guān)引物序列表

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胎盤E-cad蛋白表達(dá)：將胎盤樣品采用4%多聚甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)切成厚度5 μm的切片，常規(guī)脫蠟，乙醇梯度浸泡，蒸餾水浸泡5 min后加入3%過氧化氫溶液50 μl， 20℃下孵育10 min，對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶的活性進(jìn)行阻斷，PBS沖洗3次(每次5 min)，加入50 μl的一抗(稀釋度為1∶300)，4℃下過夜后，加入二抗(稀釋度為1∶500)，37℃下孵育15 min，采用DBA試劑進(jìn)行顯色，顯色后，蘇木素復(fù)染2 min，中性樹膠封片， 采用光學(xué)顯微鏡下觀察各視野染色分布、強(qiáng)度和面積。以PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)明顯的棕黃色染色顆粒為陽(yáng)性，無著色或與背景染色一致為陰性。采用HMIAS-2000型全自動(dòng)彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每張切片選取5個(gè)視野，測(cè)定免疫組化染色的平均光密度值(AOD)，半定量分析E-cad蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)情況比較 觀察組血清中miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，見表3。

表3 2組血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)情況比較

2.2 2組胎盤E-cad蛋白表達(dá)情況比較 2組E-cad蛋白主要表達(dá)于絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，其中對(duì)照組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞可見淺棕黃色陽(yáng)性染色，觀察組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞可見大量棕褐色陽(yáng)性染色，見圖1。觀察組E-cad蛋白AOD值(0.153±0.014)明顯高于對(duì)照組E-cad蛋白AOD值(0.186±0.017)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.207，P=0.000)。

2.3 血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)與胎盤中E-cad表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)與胎盤中E-cad表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)(r/P=0.531/0.001、0.543/0.004)。

3 討 論

隨著我國(guó)二胎政策的開放，妊娠并發(fā)癥的發(fā)生率也在不斷增加，其中妊娠高血壓是常見的并發(fā)癥，包括妊娠期高血壓、PE及子癇等，其中PE的發(fā)病率呈不斷增加的趨勢(shì)[6-7]。在全球范圍內(nèi)，PE的發(fā)病率為5%～8%，其主要特征為血管反應(yīng)異常，表現(xiàn)為血小板聚集增強(qiáng)、系統(tǒng)性血管阻力升高、內(nèi)皮細(xì)胞功能異常及凝血系統(tǒng)激活等，給孕婦及胎兒均帶來嚴(yán)重不良影響[8-9]。目前對(duì)PE的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，對(duì)其發(fā)病機(jī)制有著不同的假說，包括胎盤淺著床、過度炎性反應(yīng)、胎盤組織血供改變、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡等學(xué)說[10]。通常認(rèn)為胎盤功能異常在PE的發(fā)生及發(fā)展過程中起到重要作用[11]。

miRNA是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)關(guān)鍵的因子，通過調(diào)節(jié)眾多的靶基因，參與機(jī)體免疫應(yīng)答過程，在自身免疫疾病發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用[12-13]。miRNA在機(jī)體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及分化過程中起到重要作用，另外還參與了炎性反應(yīng)和癌變等病理過程，在肝癌、乳腺癌及直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14-15]。在妊娠過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)過程十分相似，近年研究顯示，miRNA在PE的發(fā)生及發(fā)展過程中亦起著重要作用[16]。miRNA在血液中穩(wěn)定存在，可檢測(cè)患者血清觀察其表達(dá)情況[17]。miRNA-26a-5p在肝癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、肺癌及前列腺癌等發(fā)病及發(fā)展中具有重要作用，通過調(diào)控不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)而促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移[18]。miRNA-135a-5p是miRNA-135 家族的重要成員之一，位于第3號(hào)染色體，目前被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系[19]。本研究結(jié)果顯示，miRNA-26a-5p在觀察組血清中的表達(dá)量是對(duì)照組的3.34倍左右， miRNA-135a-5p在觀察組血清中的表達(dá)量是對(duì)照組的3.16倍左右，因此筆者推測(cè)，miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p可能參與了PE的發(fā)生及發(fā)展過程。

滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕能力障礙與PE的發(fā)生有著密切關(guān)系，其機(jī)制可能為胎盤淺著床[20-22]。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵蝕能力主要受其表面黏附分子影響[23]。E-cad是一種可介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞間的黏附分子，其具有同種分子相嗜性，會(huì)介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附，在上皮細(xì)胞表面有著較廣泛的表達(dá)，對(duì)維持上皮細(xì)胞層的完整性與極性有著十分重要的作用[24-25]。在PE患者及正常妊娠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞均可見E-cad的表達(dá)，可作為滋養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，并隨著滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕能力的變化而變化，在EMT過程中均發(fā)揮重要作用[26]。本研究結(jié)果顯示，觀察組E-cad蛋白AOD值明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，說明在PE患者胎盤組織中滋養(yǎng)細(xì)胞之間的黏附能力較強(qiáng)，滋養(yǎng)細(xì)胞不易于遷移，侵蝕能力減弱。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，血清miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)與胎盤中E-cad表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.01),推測(cè)這可能是因?yàn)殡S著miRNA-26a-5p、miRNA-135a-5p表達(dá)的上調(diào)，E-cad的表達(dá)也隨之明顯上調(diào)，miRNA-26a-5p和miRNA-135a-5p通過調(diào)控E-cad使EMT過程受到抑制，阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞融合成合體滋養(yǎng)細(xì)胞，影響母胎屏障；同時(shí)使血管重鑄無法有效完成，造成胎盤淺著床，最終引發(fā)PE。

綜上所述，PE患者血清中miRNA-26a-5p和miRNA-135a-5p異常表達(dá)可能參與PE的發(fā)病，兩者可能通過E-cad調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞EMT參與PE的發(fā)病機(jī)制。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周俏苗：提出研究方向、研究思路、研究選題，論文撰寫，論文審核；汪洪林：設(shè)計(jì)研究方案、研究流程；岑慧：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);肖美芳：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理，論文修改；黃海燕：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)計(jì)論文框架;許晶：實(shí)施研究過程，資料搜集整理