汪生毅，孫小紅，李海棟，李佩章，王歲英，李玉鵬

高原地區(qū)低壓、低氧環(huán)境嚴(yán)重影響心肺、神經(jīng)系統(tǒng)功能，當(dāng)出現(xiàn)顱腦損傷后，缺氧所導(dǎo)致的腦病理?yè)p傷加重，進(jìn)一步加重病情，研究發(fā)現(xiàn)高原地區(qū)顱腦損傷發(fā)生率明顯高于平原地區(qū)[1]。顱腦損傷后會(huì)引發(fā)一系列并發(fā)癥，繼發(fā)性癲癇(secondary epilepsy，SE)是顱腦損傷的并發(fā)癥之一，病程較長(zhǎng)，發(fā)展緩慢，其發(fā)生率為2%～40%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。顱腦損傷后SE的發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，目前尚無(wú)統(tǒng)一定論[2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下發(fā)揮作用的特異性轉(zhuǎn)錄因子，研究證實(shí)腦組織缺氧后，組織中HIF-1α水平升高對(duì)腦組織具有一定的保護(hù)作用[3-4]。微小RNA-210(miR-210)主要存在于缺氧細(xì)胞及組織中，研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧腦損傷后，腦組織miR-210表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)血管再生[5]。然而HIF-1α、miR-210水平與顱腦損傷后SE的關(guān)系，目前尚不明確。現(xiàn)對(duì)高原地區(qū)顱腦損傷患兒血清HIF-1α、miR-210表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并分析兩者與顱腦損傷后SE的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月—2019年2月青海省婦女兒童醫(yī)院收治高原地區(qū)顱腦損傷患兒236例作為研究對(duì)象，根據(jù)是否發(fā)生SE分為SE組(52例)與無(wú)SE組(184例)。SE組男34例，女18例，年齡5～13(5.65±1.27)歲；格拉斯哥昏迷(GCS)評(píng)分(12.07±1.42)分；驚厥發(fā)作次數(shù)<6次18例，≥6次34例；損傷原因：擊打傷6例，擠壓傷8例，撞擊傷12例，摔傷21例，其他復(fù)合傷5例；損傷類(lèi)型：開(kāi)放性損傷31例，閉合性損傷21例；損傷部位：額葉19例，其他部位33例；合并腦挫裂傷35例，顱內(nèi)血腫21例，顱骨骨折30例，蛛網(wǎng)膜下腔出血23例。無(wú)SE組男113例，女71例，年齡4～13(6.02±1.31)歲；GCS評(píng)分(13.53±1.24)分；驚厥發(fā)作次數(shù)<6次124例，≥6次60例；損傷原因：擊打傷23例，擠壓傷29例，撞擊傷42例，摔傷76例，其他復(fù)合傷14例；損傷類(lèi)型：開(kāi)放性損傷77例，閉合性損傷107例；損傷部位：額葉75例，其他部位109例；合并腦挫裂傷62例，顱內(nèi)血腫20例，顱骨骨折25例，蛛網(wǎng)膜下腔出血31例。2組患兒性別、年齡、損傷原因、損傷部位比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而GCS評(píng)分[6]、驚厥發(fā)作次數(shù)、損傷類(lèi)型、合并腦挫裂傷、顱內(nèi)血腫、顱骨骨折、蛛網(wǎng)膜下腔出血比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.915,χ2=18.173、5.156、18.921、24.604、44.124、17.228，P均=0.000)。以HIF-1α表達(dá)量中位值1.77和miR-210表達(dá)量中位值1.64將患兒分為低表達(dá)亞組與高表達(dá)亞組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤13歲；②經(jīng)臨床、影像學(xué)等檢查確診為腦損傷；③患兒住院期間臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腦炎如麻疹腦炎、化膿性腦膜炎；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；③先天性腦血管畸形或腦發(fā)育異常造成的癲癇；④癲癇家族史；⑤顱腦損傷前有癲癇病史。

1.3 血清HIF-1α、miR-210水平檢測(cè) 患兒入院后采集空腹外周靜脈血3 ml， 離心收集上層血清，在-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)血清HIF-1α、miR-210水平。采用Trizol試劑(北京百奧萊博科技有限公司)提取血清中總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州主諾生物技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μl：2倍反應(yīng)緩沖液2 μl，MgCl24 μl，OligodT引物1 μl，AMV Reverse transcriptas 0.6 μl，RNA抑制劑0.5 μl，RNA 1 μl，滅菌水10.9 μl。反應(yīng)程序?yàn)?2℃ 溫育1 h，95℃熱激 5 min，4℃保存10 min，反應(yīng)結(jié)束后，收集cDNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，使用iQ5 Real Time型PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司)及熔解曲線分析。配制反應(yīng)體系50 μl：反應(yīng)緩沖液5 μl，Taq酶0.5 μl，dNTP 4μl，Pmix 2.5 μl，上下游引物分別為1 μl，滅菌水36 μl。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，隨后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。HIF-1α以β-actin作為內(nèi)參，miR-210以U6作為內(nèi)參，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采取2-ΔΔCt算法定量評(píng)估HIF-1α、miR-210相對(duì)表達(dá)量。

表1 HIF-1α、miR-210引物序列

2 結(jié) 果

2.1 2組血清HIF-1α、miR-210水平比較 SE組患兒血清HIF-1α、miR-210表達(dá)明顯高于無(wú)SE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組患兒血清HIF-1α、miR-210水平比較

2.2 SE組患兒血清HIF-1α、miR-210在不同臨床參數(shù)中表達(dá)比較 SE患兒HIF-1α、miR-210高表達(dá)者較低表達(dá)者GCS評(píng)分降低、驚厥發(fā)作≥6次比例增加(P<0.05)，與損傷類(lèi)型、合并癥比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同臨床參數(shù)SE患兒血清HIF-1α、miR-210表達(dá)的比較

2.3 SE患兒HIF-1α、miR-210相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，SE患兒HIF-1α與miR-210呈正相關(guān)(r=0.671，P=0.000)，HIF-1α、miR-210與GCS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.571、-0.608，P均=0.000)，與驚厥發(fā)作≥6次均呈正相關(guān)(r=0.635、0.691，P均=0.000)。

2.4 影響顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的危險(xiǎn)因素 將顱腦損傷患兒發(fā)生繼發(fā)性癲癇為因變量，以GCS評(píng)分、驚厥發(fā)作次數(shù)、損傷類(lèi)型、合并癥、HIF-1α、miR-210作為自變量進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示GCS評(píng)分低、驚厥發(fā)作次數(shù)≥6次、合并顱內(nèi)血腫、合并蛛網(wǎng)膜下腔出血、HIF-1α高表達(dá)、miR-210高表達(dá)是影響顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

表4 Logistic回歸分析影響顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的危險(xiǎn)因素

2.5 HIF-1α、miR-210在顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇中的預(yù)測(cè)價(jià)值 HIF-1α對(duì)顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預(yù)測(cè)的AUC為0.874(95%CI0.823～0.928)，最佳截?cái)嘀禐?.48，敏感度為75.67%，特異度為86.75%，約登指數(shù)為0.624；miR-210對(duì)顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預(yù)測(cè)的AUC為0.856(95%CI0.804～0.898)，最佳截?cái)嘀禐?.43，敏感度為73.08%，特異度為88.05%，約登指數(shù)為0.611，見(jiàn)圖1。

3 討 論

繼發(fā)性癲癇又稱(chēng)獲得性癲癇，患者由于神經(jīng)元異常放電造成中樞神經(jīng)功能暫時(shí)失常，常見(jiàn)的致病原因主要有顱腦損傷、顱內(nèi)感染、顱內(nèi)腫瘤等[7]。SE發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，目前尚未完全明確。顱腦損傷后可導(dǎo)致腦出血、腦挫裂傷，進(jìn)而引發(fā)腦部缺血缺氧，使大腦神經(jīng)元異常放電從而引發(fā)癲癇，因此顱腦損傷程度嚴(yán)重者發(fā)生繼發(fā)性癲癇的風(fēng)險(xiǎn)較高。本研究發(fā)現(xiàn)，SE組患兒GCS評(píng)分低于無(wú)SE組，GCS評(píng)分低是影響顱腦損傷患兒繼發(fā)癲癇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示顱腦損傷程度越高，發(fā)生繼發(fā)性癲癇風(fēng)險(xiǎn)越高。以往研究發(fā)現(xiàn)，穿透性顱腦損傷患者發(fā)生癲癇的風(fēng)險(xiǎn)較高[8]。本研究結(jié)果顯示，與無(wú)SE組相比，SE組患兒開(kāi)放性顱腦損傷比例較高，但與繼發(fā)性癲癇無(wú)關(guān)，說(shuō)明雖然開(kāi)放性顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇發(fā)生率較高，但并不是影響繼發(fā)性癲癇的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能因納入患兒數(shù)量不多導(dǎo)致。既往研究發(fā)現(xiàn)，多次驚厥是SE發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一[9]，本研究結(jié)果顯示，驚厥發(fā)作次數(shù)≥6次是顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇的危險(xiǎn)因素，與既往研究相一致，提示頻發(fā)驚厥的顱腦損傷患兒發(fā)生繼發(fā)性癲癇的風(fēng)險(xiǎn)較高。此外，研究顯示合并顱內(nèi)血腫、蛛網(wǎng)膜下腔出血也是影響繼發(fā)性癲癇發(fā)生的危險(xiǎn)因素，臨床針對(duì)此類(lèi)患兒應(yīng)高度重視，采取有效措施預(yù)防治療，以降低其發(fā)生率。

HIF-1α為缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的活性轉(zhuǎn)錄因子。以往研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷發(fā)生后腦組織中HIF-1α表達(dá)明顯升高，且HIF-1α分泌至血液中，使血清中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)或其他因子表達(dá)，促進(jìn)受損血管修復(fù)，加速新生血管形成，發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用[10]。此外研究發(fā)現(xiàn)，顱腦損傷后腦組織中HIF-1α表達(dá)顯著升高，且6 h內(nèi)維持較高水平，可上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受性[11]。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可通過(guò)介導(dǎo)Notch信號(hào)參與急性癲癇發(fā)生，阻斷該通路后可下調(diào)HIF-1α，降低癲癇發(fā)生率。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，硒誘導(dǎo)的癲癇過(guò)程中，HIF-1α可通過(guò)腫瘤壞死因子-α途徑造成神經(jīng)細(xì)胞死亡。以上研究均表明HIF-1α與腦損傷及癲癇的發(fā)生有關(guān)，然而HIF-1α與腦損傷后繼發(fā)癲癇的關(guān)系，目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)與無(wú)SE組相比，SE組患兒血清HIF-1α表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其與GCS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)、與驚厥發(fā)作次數(shù)呈正相關(guān)，表明腦損傷程度越高，驚厥發(fā)作次數(shù)越多，則HIF-1α表達(dá)越高，提示HIF-1α參與顱腦損傷后繼發(fā)性癲癇發(fā)生過(guò)程。ROC分析發(fā)現(xiàn)HIF-1α對(duì)顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預(yù)測(cè)的AUC為0.874，最佳截?cái)嘀禐?.48，敏感度為75.67%，特異度為86.75%，約登指數(shù)為0.624，提示HIF-1α對(duì)顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

大量研究證實(shí)，miRNA異常表達(dá)與腦部疾病的發(fā)生有關(guān)，F(xiàn)eng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠腦組織中miR-301a顯著升高。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死大鼠腦組織中miR-155-5p表達(dá)明顯升高，抑制miR-155-5p可增強(qiáng)腦細(xì)胞活力。以上研究均表明miRNA與腦部疾病的發(fā)生明顯有關(guān)。miR-210是與缺氧有關(guān)的miRNA，與組織缺氧/缺血、腫瘤及炎性反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者血清miR-210表達(dá)顯著升高。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，且與患者預(yù)后不良有關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-210通過(guò)靶向腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移、侵襲。然而目前miR-210與顱腦損傷的關(guān)系尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)與無(wú)SE組相比，SE組患兒血清miR-210表達(dá)顯著升高，且與GCS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與驚厥發(fā)作次數(shù)呈正相關(guān)，提示血清miR-210表達(dá)水平的增加與顱腦損傷后繼發(fā)性癲癇發(fā)生有關(guān)。ROC分析發(fā)現(xiàn)，miR-210對(duì)顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇預(yù)測(cè)的AUC為0.856，最佳截?cái)嘀禐?.43，敏感度為73.08%，特異度為88.05%，約登指數(shù)為0.611。提示miR-210在顱腦損傷患兒繼發(fā)性癲癇中具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，有可能作為此類(lèi)患兒診斷標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)miR-210可通過(guò)靶基因參與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成等過(guò)程，HIF-1α可結(jié)合miR-210轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)上游的低氧反應(yīng)元件，進(jìn)而調(diào)節(jié)miR-210表達(dá)[18]。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)HIF-1α/miR-210信號(hào)通路，可減輕低氧性腦損傷大鼠細(xì)胞凋亡及線粒體能量代謝紊亂。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-210通過(guò)靶向HIF-1α保護(hù)腎細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)miR-210與HIF-1α呈明顯正相關(guān)，推測(cè)在顱腦損傷時(shí)患兒腦組織出現(xiàn)缺血缺氧，miR-210表達(dá)升高，造成HIF-1α表達(dá)增加，使腦組織對(duì)缺血環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性變化。

綜上所述，在顱腦損傷患兒血清中miR-210、HIF-1α表達(dá)的增加與繼發(fā)性癲癇發(fā)生有關(guān)，可作為判斷顱腦損傷繼發(fā)性癲癇的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。然而本研究?jī)H初步探究?jī)烧叩南嚓P(guān)性，具體機(jī)制尚不清楚，仍需后續(xù)深入探究，以期為疾病的診療提供充分的理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

汪生毅：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；孫小紅：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；李海棟：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；李佩章：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；王歲英、李玉鵬：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)