盧平，武懿茂，武強(qiáng)強(qiáng)，李雪垠

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

谷子（Setaria italica）屬于1年生草本植物，為二倍體禾本科作物（2n＝18），起源于我國(guó)，具有悠久的栽培歷史，我國(guó)的黃河中上游為主要栽培區(qū)。谷子是C4植物，耐旱、耐貧瘠，是發(fā)掘農(nóng)作物抗旱基因和研究作物抗旱分子機(jī)制的優(yōu)良種質(zhì)資源[1]。2012年谷子的基因組測(cè)序已經(jīng)完成，為谷子功能基因組學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)平臺(tái)[2-3]。目前，谷子逐漸成為理想的模式作物之一，主要應(yīng)用于禾本科植物的基因組學(xué)研究。谷子脫殼后稱為小米，小米富含蛋白質(zhì)、脂肪、鐵、類胡蘿卜素、纖維素和維生素等，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高；還可作為藥物[4]，具有清熱、滋陰、治水瀉等功效；又可以用來(lái)釀酒。谷子的莖葉又可以用作牲畜的優(yōu)等飼料。因此，其越來(lái)越受到人們的重視。

轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控下游基因的時(shí)空特異性表達(dá)，是真核生物中重要的調(diào)控蛋白。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答過(guò)程的關(guān)鍵因子。堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper,bZIP）轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于真核生物基因組，是數(shù)量最大、最保守的基因家族之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、病原防御、高溫以干旱脅迫應(yīng)答等生物和非生物脅迫反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用[5]。因此，bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因鑒定和功能分析等研究在后基因組時(shí)代中是較為活躍的研究領(lǐng)域。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是以共有的bZIP保守結(jié)構(gòu)域?yàn)橐罁?jù)而被命名的。bZIP結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)C端的堿性氨基酸區(qū)域和一個(gè)N端的亮氨酸拉鏈區(qū)域，bZIP保守結(jié)構(gòu)域包含了60～80個(gè)氨基酸，其中，堿性區(qū)域含有一個(gè)保守基序N-x7-R/K-x9，該保守基序由16～20個(gè)氨基酸殘基組成，這個(gè)區(qū)域參與細(xì)胞核的定位與DNA識(shí)別[6-7]；亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域由若干個(gè)兩親α螺旋構(gòu)成，在α螺旋中每隔6個(gè)氨基酸就出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸或其他疏水性的氨基酸，例如纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸。

在植物中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)包括病原防御、光反應(yīng)和脅迫信號(hào)、種子成熟和花發(fā)育等過(guò)程[8]。在很多植物中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員已經(jīng)被鑒定或預(yù)測(cè)完成。在模式植物擬南芥和水稻中，分別包含75個(gè)和89個(gè)bZIP家族的成員[9-10]。在擬南芥中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)ABA途徑調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫等過(guò)程[11]；在水稻中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子與干旱脅迫和花粉發(fā)育相關(guān)[12-13]；在小麥中，有48個(gè)bZIP基因與花藥發(fā)育有關(guān)[14]；在辣椒中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠抵御病原感染和非生物脅迫[15]。迄今為止，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥和水稻中的抗逆性研究較為深入，但在谷子中的研究卻相對(duì)較少[16]。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行全基因組鑒定，并分析其家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、保守基序、啟動(dòng)子順式作用元件和表達(dá)量水平，旨在為進(jìn)一步研究谷子bZIP基因功能和分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 全基因組鑒定和蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

根據(jù)Pfam（http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子的Pfam編號(hào)，在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）v12數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出85個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因，并下載它們的基因組序列、編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS）和蛋白質(zhì)序列。根據(jù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子在染色體上的位置命名，谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因的染色體定位和基因組位置信息來(lái)源于Phytozome。利用ExPASy-Compute pI/Mw（https：//web.expasy.org/compute_pi/）網(wǎng)站計(jì)算谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和分子量。

1.2 系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用MEGA 7.0軟件對(duì)85條谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)（Clustal W）；采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，參數(shù)Bootstrap值設(shè)為1 000，其余參數(shù)默認(rèn)。利用Gene Structure Display Server 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng) 站預(yù)測(cè)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)構(gòu)，包括外顯子、內(nèi)含子和上下游區(qū)域。

1.3 蛋白質(zhì)模體和基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)

利用網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/）上傳氨基酸序列，分析谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)模體，模體數(shù)目設(shè)置為15個(gè)。

利用Phytozome網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)Setaria italica v2.2下載bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因的5′UTR上游1.5 kb序列（包括5′UTR）作為谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子序列。利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子上的順式作用元件。

1.4 基因組織特異性和環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)預(yù)測(cè)

利用TBtools，根據(jù)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因在不同組織中和不同環(huán)境中的表達(dá)數(shù)據(jù)繪制熱圖。谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因不同組織、不同條件下的表達(dá)量數(shù)據(jù)來(lái)源于Phytozome Setaria italica v2.2數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組鑒定及其蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析

表1對(duì)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因編號(hào)、染色體定位、基因組位置、基因長(zhǎng)度、CDS長(zhǎng)度、氨基酸個(gè)數(shù)、蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，利用Phytozome網(wǎng)站在谷子全基因組水平鑒定了bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因共85個(gè)，根據(jù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子在染色體和基因組位置上的分布，按順序依次命名為SibZIP1～SibZIP85。谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因在1～9號(hào)染色體上的數(shù)量分別是10、15、13、10、12、7、4、3、11個(gè)，分布不均勻。

表1谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因基本信息及其蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)

續(xù)表1

在谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)中，氨基酸個(gè)數(shù)最多的蛋白質(zhì)是SibZIP35，有645個(gè)；最少的是SibZIP52，有140個(gè)。谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)介于4.69～11.97，分子量在15.507～68.096 ku。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)偏高通常與其較高的堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨酸、組氨酸）含量有關(guān)。例如SibZIP38、SibZIP61、SibZIP78、SibZIP83蛋白質(zhì)等電點(diǎn)較高，分別為11.41、11.97、11.03、10.17，因?yàn)檫@幾個(gè)SibZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)有較多的堿性氨基酸，因此等電點(diǎn)也較高。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

對(duì)谷子85條bZIP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1（左）所示，部分SibZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員親緣關(guān)系較為相近，如SibZIP19/SibZIP68、SibZIP85/SibZIP79、SibZIP74/SibZIP70、SibZIP23/SibZIP80、SibZIP1/SibZIP51、SibZIP35/SibZIP22、SibZIP4/SibZIP44、SibZIP33/SibZIP60、SibZIP34/SibZIP48、SibZIP74/SibZIP70。因此，它們可能是旁系同源基因，由同一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子祖先基因復(fù)制產(chǎn)生。圖1（右）為谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因的外顯子－內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)情況分析。由圖1可知，85個(gè)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子中親緣關(guān)系較為相近的基因結(jié)構(gòu)也較為相似，如SibZIP19/SibZIP68、SibZIP85/SibZIP79、SibZIP74/SibZIP70、SibZIP23/SibZIP80，每組外顯子的個(gè)數(shù)都相等、長(zhǎng)度相似，說(shuō)明親緣關(guān)系較近的SibZIP基因的基因結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的保守性。

2.3 蛋白質(zhì)模體和啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用網(wǎng)站MEME分析谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)模體，結(jié)果如圖2所示，谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)了15個(gè)模體，分別為模體motif1～motif15；85個(gè)bZIP蛋白質(zhì)都含有motif1，說(shuō)明motif1在谷子bZIP蛋白質(zhì)中分布最廣，保守性最強(qiáng)；motif1有41個(gè)氨基酸，其中，5、10、17、19位的R（精氨酸）和27、34、41位的L（亮氨酸）具有較強(qiáng)的保守性，符合bZIP堿性亮氨酸拉鏈的特征。

部分bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)模體差異較大，一些親緣關(guān)系較近的bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)模體也較為相似。如SibZIP23和SibZIP80都具有motif1、motif4和motif12這3個(gè)motif；SibZIP2和SibZIP50、SibZIP4和SibZIP44、SibZIP34和SibZIP48都僅有motif1；SibZIP25和SibZIP81、SibZIP57和SibZIP31都具有motif1、motif8、motif10、motif11。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物中參與生長(zhǎng)發(fā)育、光的形態(tài)建成和防御與脅迫應(yīng)答等生理過(guò)程。為了探究SibZIP轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件與谷子生理過(guò)程的關(guān)系，本研究利用PlantCARE網(wǎng)站分析85個(gè)bZIP基因的啟動(dòng)子順式作用元件，部分結(jié)果如表2所示，其中，AuxRR-core、TGA-element和P-box元件功能涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的激素調(diào)控；G-box、GT1-motif和Sp1元件功能涉及植物光反應(yīng)調(diào)控；ABRE元件功能涉及植物ABA響應(yīng)。ABA不僅能夠抑制植物生長(zhǎng)，還能夠在干旱、寒冷、高溫、鹽漬和水澇等逆境中增強(qiáng)植物抗逆性。MBS元件是MYB結(jié)合位點(diǎn)，其功能涉及植物干旱誘導(dǎo)；TC-rich repeats元件功能涉及植物防御和應(yīng)激反應(yīng)；ABRE、MBS和TC-rich repeats元件涉及防御與脅迫應(yīng)答。

SibZIP78基因啟動(dòng)子中含有16個(gè)G-box元件；SibZIP75基因啟動(dòng)子中含有11個(gè)G-box元件和1個(gè)Sp1元件；SibZIP78、SibZIP54基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)含有較多的光響應(yīng)相關(guān)順式作用元件；SibZIP54基因啟動(dòng)子中含有1個(gè)AuxRR-core元件和3個(gè)TGA-element元件，SibZIP79基因啟動(dòng)子中含有1個(gè)AuxRR-core元件、1個(gè)P-box元件和1個(gè)TGA-element元件，SibZIP54、SibZIP79基因啟動(dòng)子富含激素調(diào)控相關(guān)的順式作用元件；SibZIP78基因啟動(dòng)子中含有15個(gè)ABRE元件，SibZIP71基因啟動(dòng)子中含有14個(gè)ABRE元件，SibZIP2基因啟動(dòng)子中含有12個(gè)ABRE元件，SibZIP73基因啟動(dòng)子中含有9個(gè)ABRE元件和2個(gè)MBS元件，這4個(gè)基因啟動(dòng)子富含ABRE元件或MBS元件等與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件（表2、3）。

表2谷子bZIP基因啟動(dòng)子順式作用元件種類與數(shù)目

續(xù)表2

表3谷子bZIP基因啟動(dòng)子順式作用元件核心序列與功能

2.4 組織特異性和環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)分析

利用TBtools軟件制作熱圖，可以較為明顯地顯示出谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因在不同組織及不同環(huán)境誘導(dǎo)的表達(dá)情況（圖3），表達(dá)情況相似的基因聚在一起。SibZIP3、SibZIP14、SibZIP48、SibZIP66等在不同條件下（10 d光照處理、干旱處理、硝酸處理、尿素處理、氨處理）的根中均有較高的表達(dá)量；SibZIP39、SibZIP75和SibZIP76等在圓錐花序中具有較高的表達(dá)量；SibZIP19、SibZIP20和SibZIP46等主要在光照下的葉片中表達(dá)；SibZIP21、SibZIP67、SibZIP79和SibZIP85均在黃化苗（Etiolated seedling）暗處理培養(yǎng)5 d的情況下具有較高的表達(dá)量；SibZIP31在遠(yuǎn)紅光處理下特異表達(dá)；SibZIP17和SibZIP71在暗處理的地上部分中表達(dá)量較高；SibZIP11、SibZIP12和SibZIP72等在干旱處理的根中表達(dá)量較高。

3 結(jié)論與討論

谷子是C4植物，具有耐旱、耐貧瘠、水分利用率高和蒸騰系數(shù)低等特性，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，耐逆境脅迫能力較其他作物更強(qiáng)。因此，對(duì)谷子的基礎(chǔ)研究和抗逆基因資源的挖掘成為新的研究熱點(diǎn)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物中不僅能夠調(diào)節(jié)病原防御、脅迫應(yīng)答等過(guò)程，還能夠調(diào)控光的形態(tài)建成、激素信號(hào)傳導(dǎo)、花發(fā)育和種子成熟與萌發(fā)等過(guò)程。植物的抗逆境脅迫反應(yīng)機(jī)制非常復(fù)雜，因此參與調(diào)控植物抗逆脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子很多，除bZIP外，還有MYB、NAC、WRKY、HSF等[16-21]。

本研究利用生物信息學(xué)手段對(duì)谷子基因組中bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行全基因組鑒定，并對(duì)所有家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，經(jīng)鑒定得到的85個(gè)SibZIP轉(zhuǎn)錄因子，分布在谷子的第1～9條染色體上，部分SibZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有一定保守性。親緣關(guān)系相近的轉(zhuǎn)錄因子往往是由具有相似的基因結(jié)構(gòu)和相似蛋白質(zhì)模體組成，如SibZIP4/SibZIP44、SibZIP34/SibZIP48。SibZIP轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序較多、較為復(fù)雜，并且SibZIP轉(zhuǎn)錄因子具有多種多樣的生物學(xué)功能。SibZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因啟動(dòng)子順式作用元件種類較多，包括與谷子防御脅迫相關(guān)的順式作用元件和谷子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程相關(guān)的順式作用元件。如SibZIP78、SibZIP75啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)含有較多與光響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件。因此，這2個(gè)基因可能參與谷子光反應(yīng)調(diào)控。SibZIP54、SibZIP79基因啟動(dòng)子中含有AuxRR-core、P-box或TGA-element元件的SibZIP轉(zhuǎn)錄因子，可能參與植物生長(zhǎng)素、赤霉素的調(diào)控；SibZIP2、SibZIP71、SibZIP73等轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子富含ABRE、MBS、TC-rich repeats或LTR元件的SibZIP轉(zhuǎn)錄因子，可能參與植物非生物脅迫調(diào)節(jié)、防御和應(yīng)激反應(yīng)。

通過(guò)對(duì)SibZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員表達(dá)量分析可知，SibZIP3/SibZIP14/SibZIP48、SibZIP39/SibZIP75/SibZIP76和SibZIP19/SibZIP20/SibZIP46分別在根、圓錐花序和葉片中具有較高的表達(dá)量。因此，推測(cè)這些bZIP轉(zhuǎn)錄因子在根、圓錐花序和葉片中特異表達(dá)，參與根、圓錐花序和葉片的生長(zhǎng)發(fā)育。SibZIP21和SibZIP67均在黃化苗暗處理情況下具有較高的表達(dá)量，并且SibZIP21和SibZIP67基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)模體較為相似。因此，推測(cè)它們功能相似，可能參與谷子暗反應(yīng)。SibZIP30和SibZIP61在光照處理的根中具有較高表達(dá)量，說(shuō)明這2個(gè)SibZIP基因可能參與谷子根部光反應(yīng)。SibZIP31在遠(yuǎn)紅光處理下特異表達(dá)，說(shuō)明遠(yuǎn)紅光能誘導(dǎo)SibZIP31基因表達(dá)。SibZIP17和SibZIP71在暗處理地上部分中表達(dá)量較高，說(shuō)明黑暗能誘導(dǎo)SibZIP17和SibZIP71表達(dá)。SibZIP11、SibZIP12和SibZIP72等在干旱處理的根中表達(dá)量較高，說(shuō)明干旱能夠誘導(dǎo)其表達(dá)，這3個(gè)SibZIP基因可能參與谷子根部的干旱脅迫應(yīng)答。

在植物中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能是多樣的，不同的家族成員作用不同。因此，對(duì)bZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能和作用機(jī)制的研究十分重要。高等植物中部分bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員已經(jīng)有了較為廣泛的研究，接下來(lái)可以利用基因克隆、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步研究bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物中的調(diào)控機(jī)制，從而更深入了解高等植物遺傳進(jìn)化、生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的過(guò)程。

本研究依據(jù)生物信息學(xué)方法，對(duì)谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行全基因組鑒定，對(duì)基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)模體、啟動(dòng)子順式作用元件和表達(dá)量水平進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，其結(jié)果為更深入研究谷子bZIP轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能及其在谷子中的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)機(jī)制提供了參考。