胡紀(jì)文，王恩運(yùn)，闞麗娟，豆小文，賴柚霞，徐 莎，姜瑞偉，張秀明

(深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東深圳 518001)

新型冠狀病毒的流行和傳播已經(jīng)成為影響世界各國的嚴(yán)重公共衛(wèi)生事件，感染患者的“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早診斷、早治療”對(duì)控制疫情蔓延至關(guān)重要。新型冠狀病毒屬于β 屬的冠狀病毒，其基因特征與急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-relatedcoronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-relatedcoronavirus，MERSr-CoV）有明顯區(qū)別。有研究結(jié)果顯示，新型冠狀病毒與蝙蝠嚴(yán)重急性呼吸綜合征樣冠狀病毒（bat-SLCoVZC45）同源性達(dá)85%以上[1-2]，國際病毒分類委員會(huì)冠狀病毒研究小組將其命名為“嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒”（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）[3]，由 其 引發(fā)的疾病被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。從 目前的認(rèn)知來看，在毒性上，新型冠狀病毒比SARS弱，而在傳染性上，新型冠狀病毒比SARS 更強(qiáng)。因新型冠狀病毒潛伏期長，無癥狀感染者也存在傳染性，且人群全部易感，因此研究快速且有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，對(duì)SARS-CoV-2 感染的篩查和診斷具有重要價(jià)值?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第七版）》明確將抗體檢測(cè)結(jié)果納入確診病例的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以及疑似病例的排除標(biāo)準(zhǔn)。如果疑似病例血清特異性IgM 和IgG 抗體陽性，IgG 抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期有4 倍及以上升高，則可以診斷其感染了新型冠狀病毒。疑似病例的排除標(biāo)準(zhǔn)需要同時(shí)滿足病毒核酸檢測(cè)結(jié)果陰性以及發(fā)病7d 后新型冠狀病毒IgM 和IgG 抗體仍為陰性兩個(gè)條件[2]。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescence immunoassay，CLIA）檢測(cè)新型冠狀病毒血清IgM 和IgG 抗體具備高通量、方法穩(wěn)定、安全性高、可以定量等特點(diǎn)而成為SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)的主要手段。自疫情暴發(fā)以來，國內(nèi)已有多個(gè)廠家生產(chǎn)的新型冠狀病毒血清IgM 和IgG 抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒在臨床上應(yīng)用。本文評(píng)估比較了三個(gè)不同廠家化學(xué)發(fā)光法試劑盒對(duì)SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗體的檢測(cè)性能，并探討了抗體檢測(cè)對(duì)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的臨床診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年1～4月深圳市已確診的COVID-19 患者37 例為病例組，均為康復(fù)期患者，病程≥20 天；選取同期羅湖醫(yī)院門診和住院患者100 例作為對(duì)照組，核酸檢測(cè)均為陰性，臨床排除新型冠狀病毒感染。動(dòng)態(tài)觀察1 例患者來自羅湖醫(yī)院發(fā)熱門診。實(shí)驗(yàn)方案獲得羅湖區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：實(shí)驗(yàn)儀器分別采用新產(chǎn)業(yè)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀（Maglumi 800）、博奧塞斯Axceed260化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀和亞輝龍iModules 化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀。

1.2.2 試劑：三種SARS-CoV-2 抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒分別為試劑A（IgM 批號(hào)：20200304；IgG批號(hào)：20200304）、試劑B（IgM 批號(hào)：G202004305；IgG 批號(hào)：G202004307）、試 劑C（IgM 批號(hào)：2722000202；IgG 批號(hào)：2722000201）。新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測(cè)試劑盒購自上海伯杰公司（批號(hào)：20200424C）。

1.3 方法

1.3.1 使用病毒采集管采集受試者鼻咽拭子標(biāo)本，按照SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)試劑盒說明書操作進(jìn)行樣本處理、核酸提取和PCR 擴(kuò)增。

1.3.2 采集受試者3 ml 靜脈血，置于含惰性分離膠的真空干燥管中，3 000 r/min 離心10 min 分離血清，檢測(cè)SARS-CoV-2 抗體。所有操作嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果判讀參照各試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用GraphPad Prism 5 軟件繪制ROC 曲線，試劑A 的臨界值（Cut off 值）為S/CO ≥1 AU/ml，試 劑B 的Cut off 值 為≥1.0，試 劑C 的Cut off 值 為≥10 AU/ml；≥Cut off 值判定為陽性，＜Cut off 值判定為陰性，并計(jì)算靈敏度與特異度。采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。一致性分析采用Kappa 一致性檢驗(yàn)，0 ≤Kappa ≤0.2 為微弱一致性，0.2 ＜Kappa ≤0.4為弱一致性，0.4＜Kappa ≤0.6 為中度一致性，0.6＜Kappa ≤0.8 為高度一致性，0.8＜Kappa ≤1.0為極強(qiáng)一致性。

2 結(jié)果

2.1 三種化學(xué)發(fā)光新型冠狀病毒抗體檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)估 采用37 例臨床確診的COVID-19 患者康復(fù)期血清樣本和100 例對(duì)照組血清樣本對(duì)三種不同廠家的化學(xué)發(fā)光新型冠狀病毒抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示康復(fù)期COVID-19 患者血清IgM和IgG 水平顯著高于對(duì)照組。對(duì)于IgM 抗體檢測(cè)，除試劑C 外，試劑A 和試劑B 的AUC 值均大于0.9，表明試劑A 和試劑B 對(duì)于新型冠狀病毒IgM 抗體檢測(cè)具有非常好的檢測(cè)性能，尤其是試劑B 性能最優(yōu)，臨床敏感度為56.76%，臨床特異度為99%。對(duì)于IgG 抗體檢測(cè)，三種試劑的AUC 值均大于0.9，均具有非常好的檢測(cè)性能，三種試劑的臨床特異度均為97.00%，而試劑C 的臨床敏感度最高，為97.29%。見圖1，圖2，表1。

圖1 三種化學(xué)發(fā)光試劑新型冠狀病毒IgM 抗體檢測(cè)性能

圖2 三種化學(xué)發(fā)光試劑新型冠狀病毒IgG 抗體檢測(cè)性能

表1 三種新型冠狀病毒化學(xué)發(fā)光試劑盒IgM 和IgG 抗體檢測(cè)性能評(píng)估

2.2 三種化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性評(píng)價(jià) 見表2，表3。利用Kappa 值對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法試劑A,B,C 的抗體檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，對(duì)于IgM 抗體檢測(cè)，試劑A 與試劑B 的Kappa 值最高，為0.508，試劑C 與試劑B的Kappa 值最低，為0.065，提示試劑A 與試劑B IgM 檢測(cè)結(jié)果具有中度一致性，試劑C 與試劑BIgM 檢測(cè)結(jié)果僅具有微弱一致性。對(duì)于IgG 抗體檢測(cè)，試劑A 與試劑C 的Kappa 值最高，為0.654，試劑A 與試劑B 的Kappa 值最低，為0.102，提示試劑A 與試劑C IgM 檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，試劑A 與試劑B IgM 檢測(cè)結(jié)果為弱一致性。

表2 三種化學(xué)發(fā)光試劑盒IgM 檢測(cè)結(jié)果的一致性分析

表3 三種化學(xué)發(fā)光試劑盒IgG 檢測(cè)結(jié)果的一致性分析

2.3 1 例患者新型冠狀病毒抗體水平和核酸水平變化的動(dòng)態(tài)觀察 見表4。患者男性，32 歲，于2020年4月18日從武漢返回深圳，鼻咽拭子核酸檢測(cè)陰性，未做抗體檢測(cè)，在深圳某酒店隔離，隔離期間于24日再次采集鼻咽拭子核酸檢測(cè)仍陰性，但特異性IgM 和IgG 抗體陽性（試劑B），結(jié)合流行病學(xué)史和有輕微流涕，以疑似病例收入我院隔離病區(qū)。入院第3 天，核酸檢測(cè)仍為陰性，特異性IgM和IgG 抗體檢測(cè)仍為陽性。入院第5 天，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)呈現(xiàn)非常弱的陽性（ORF1ab 基因Ct值38.36，N 基因Ct 值37.51，Cut-off 值≤38），經(jīng)深圳市CDC 二次采樣咽拭子復(fù)核結(jié)果呈陽性。

表4 1 例新冠患者的抗體（S/CO）和核酸檢測(cè)的動(dòng)態(tài)觀察

3 討論

當(dāng)人體受到新型冠狀病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞會(huì)分泌產(chǎn)生特異性抗體。IgM 抗體在急性感染3～7 天后產(chǎn)生，可以反映機(jī)體是否處于急性感染早期；IgG 抗體在感染7 天左右開始產(chǎn)生，可作為診斷現(xiàn)癥感染和既往感染的指標(biāo)；IgM 和IgG 抗體聯(lián)合檢測(cè)可以監(jiān)測(cè)患者整個(gè)疾病過程中的抗體表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)IgM 和IgG 抗體有助于提高檢測(cè)的陽性率[4-6]?？贵w檢測(cè)可以作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充，在臨床診斷中也廣泛使用。但是由于疫情突發(fā)，研制抗體檢測(cè)試劑時(shí)間緊迫，導(dǎo)致臨床所使用試劑檢測(cè)性能存在較大差異，為此本研究對(duì)三種不同廠家的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了評(píng)估和比較，以期為抗體檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用提供借鑒。

目前SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)試劑盒主要選擇刺突糖蛋白（spike glycoprotein, S）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein, N）融合片段作為包被抗原，也有單獨(dú)使用S 蛋白或N 蛋白作為包被抗原。S 蛋白是病毒感染人體細(xì)胞的武器[4]，針對(duì)S 蛋白受體結(jié)合區(qū)SRBD 蛋白的抗體具中和病毒的作用，采用SRBD 蛋白作為抗原檢測(cè)到的IgG 抗體的出現(xiàn)并持續(xù)升高，應(yīng)具有很好的預(yù)后及康復(fù)指示價(jià)值。SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS 病毒N 蛋白有高度同源性[7]，N 蛋白是冠狀病毒中產(chǎn)生最早且含量較多的蛋白質(zhì)，具有較強(qiáng)的免疫原性和特異性，是抗體診斷材料的主要材料之一，由于N 蛋白抗體在發(fā)病10 天左右才開始大量產(chǎn)生，有研究認(rèn)為N 蛋白抗體作為早期診斷指標(biāo)可能存在一定的不足[8-9]。目前已有大量研究提示，不同種冠狀病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反應(yīng)。因此，SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)可受其他種類冠狀病毒的影響，可能具有一定的假陽性率，但還需在臨床檢測(cè)中進(jìn)一步證實(shí)[10]。本研究結(jié)果顯示，三種試劑盒間的臨床敏感度及一致性有較大的差異，主要原因是不同廠家試劑盒選擇了不同的包被抗原以及采用不同的生產(chǎn)工藝，其中試劑A 采用S 蛋白與N 蛋白混合包被，試劑B采用S 蛋白包被，試劑C 采用S 蛋白與N 蛋白融合片段包被。除了包被抗原種類選擇的不同，不同廠家選擇的體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)也有差異。體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要包括真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。其中原核表達(dá)系統(tǒng)以大腸埃希菌表達(dá)為主，真核表達(dá)系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于抗體檢測(cè)的敏感性和特異性也有影響。此外，針對(duì)抗體的不同檢測(cè)方法（雙抗原夾心法、間接法、捕獲法等）的差異也會(huì)對(duì)試劑盒的敏感度、特異度產(chǎn)生影響。因此產(chǎn)品性能的標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)品工藝的標(biāo)準(zhǔn)化亟待解決。

病毒核酸檢測(cè)作為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”其特異度較其他方法學(xué)都高，但是目前的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)不少假陰性的結(jié)果，這意味著一些感染了病毒的患者會(huì)被漏診，國外文獻(xiàn)報(bào)道假陰性率為2%～18%，主要原因包括目前PCR 技術(shù)存在低拷貝數(shù)漏檢問題、樣本采集不當(dāng)導(dǎo)致檢測(cè)失敗、樣本提取過程因污染導(dǎo)致核酸降解[11-12]。而SARSCoV-2 特異性抗體可以作為核酸檢測(cè)的重要補(bǔ)充，若疑似患者的核酸檢測(cè)是陰性，可以對(duì)抗體進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，若抗體檢測(cè)出現(xiàn)陽性，應(yīng)引起臨床的高度懷疑。在本研究中，動(dòng)態(tài)觀察1 例患者SARSCoV-2 抗體（IgM,IgG）的抗體水平和核酸水平變化，該患者在首診和第3 天時(shí)核酸檢測(cè)均為陰性，但是IgM 和IgG 抗體呈現(xiàn)雙陽，且IgM 第3 天滴度比首診高1倍，高度疑似新型冠狀病毒感染。到第5天時(shí)，患者核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)槿蹶栃?，?jīng)過復(fù)核后最終確診。研究結(jié)果提示，對(duì)于此類臨床表現(xiàn)隱匿，且核酸水平非常低導(dǎo)致早期核酸檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性的患者，血清抗體水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于新型冠狀病毒感染的明確診斷，避免漏檢。

采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM 和IgG抗體有較高的敏感度和特異度，可以作為SARSCoV-2 篩查和診斷的有效手段[13。