譚玉華，曹春玲，邢曉敏，周曉姍，謝敬玲，馮健明

（1.廣州市豐華生物工程有限公司體外診斷試劑研發(fā)中心，廣州 510730；2.廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所中山檢驗(yàn)室，廣東中山 528400）

妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是由胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的大分子糖蛋白，其功能可調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)，保護(hù)胎兒免遭排斥。孕早期的PAPP-A 對(duì)罹患21-三體綜合征胎兒的識(shí)別能力是迄今為止最敏感的孕早期篩查的首選血清標(biāo)志物。目前，PAPP-A 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化還面臨許多問題，不同實(shí)驗(yàn)間的檢測(cè)結(jié)果差異明顯[1]。近年我國(guó)實(shí)施了PAPP-A 檢測(cè)試劑盒醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（簡(jiǎn)稱PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）[2]，規(guī)范了我國(guó)PAPP-A 產(chǎn)品質(zhì)量，且《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》要求檢驗(yàn)程序在常規(guī)應(yīng)用前，實(shí)驗(yàn)室需對(duì)檢驗(yàn)程序性能進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，確定檢驗(yàn)程序的性能特征足以保證其能夠達(dá)到臨床檢測(cè)所要求[3]。由于產(chǎn)前篩查血清標(biāo)志物要求靈敏度高、線性范圍寬，并且將中位數(shù)及中位數(shù)倍數(shù)（multiple of median,MOM）應(yīng)用于血清學(xué)產(chǎn)前篩查是一個(gè)非常重要的手段，但儀器所配軟件內(nèi)置初始中位數(shù)往往與實(shí)際篩查數(shù)據(jù)并不匹配。時(shí)間分辨熒光免疫分析法(time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)作為具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和線性范圍寬等特點(diǎn)的第三代標(biāo)記免疫技術(shù)之一，在國(guó)內(nèi)也已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了TRFIA的自動(dòng)化。因此，筆者對(duì)國(guó)產(chǎn)Auto TRFIA-4 型自動(dòng)熒光免疫分析儀與試劑盒檢測(cè)PAPP-A 進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)和建立了參考區(qū)間，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集了2 519 例孕早期不同孕周的臨床檢測(cè)過的孕母血清剩余樣本，用于參考區(qū)間的建立，其中孕9 ～ 9+6周314 例，孕10 ～ 10+6周372例，孕11 ～ 11+6周405 例，孕12 ～ 12+6周766 例，孕13 ～ 13+6周662 例。并收集了66 例孕早期不同孕周的臨床檢測(cè)過的孕母血清剩余樣本用于方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑 廣州市豐華生物工程有限公司生產(chǎn)的PAPP-A 測(cè)定試劑盒（時(shí)間分辨熒光免疫分析法）和Auto TRFIA-4 型自動(dòng)熒光免疫分析儀組成待評(píng)價(jià)系統(tǒng)。芬蘭Wallac Oy 公司生產(chǎn)的PAPP-A 測(cè)定試劑盒（時(shí)間分辨熒光法）和AutoDELFIA?1235 型全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)組成的對(duì)比系統(tǒng)。低值、中值和高值質(zhì)量控制品由廣州市豐華生物工程有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 檢出限評(píng)價(jià)：待評(píng)價(jià)系統(tǒng)重復(fù)測(cè)定零濃度校準(zhǔn)品（校準(zhǔn)品A）20 次，計(jì)算出反應(yīng)量（熒光信號(hào)值）的平均值(average, x)和標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation,s），將x+2s 的反應(yīng)量采用同步檢測(cè)校準(zhǔn)品得到的劑量-反應(yīng)曲線擬合，計(jì)算出相應(yīng)濃度值為空白限。根據(jù)PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[2]要求的檢出限應(yīng)不高于25 mIU/L，參考PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法，對(duì)5 份近似25 mIU/L 的低值樣本（理論濃度為22.51，22.70，23.18，23.73，24.37mIU/L）進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本檢測(cè)5 次，對(duì)所有檢測(cè)結(jié)果按照大小進(jìn)行排序，低于空白限數(shù)值的檢測(cè)結(jié)果的數(shù)量應(yīng)≤3 個(gè)。

1.3.2 線性評(píng)價(jià)：將高值樣本準(zhǔn)確稀釋成理論濃度 為9.00，24.00，40.00，200.00，1 000.00 和2 530.00 mIU/L 的6 個(gè)梯度。參考PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[2]，待評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)每一濃度的樣本重復(fù)測(cè)定2 次，計(jì)算其X 作為實(shí)測(cè)濃度，將實(shí)測(cè)濃度與理論濃度用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，應(yīng)至少在覆蓋25.00 ～2 500.00 mIU/L 線性范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)（related coefficient,r）≥0.990 0。

1.3.3 精密度評(píng)價(jià)：參考PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法[2]，待評(píng)價(jià)系統(tǒng)采用同一批號(hào)國(guó)產(chǎn)試劑盒，在一次實(shí)驗(yàn)中分別平行測(cè)定高、中、低三種不同濃度的質(zhì)量控制品各10 次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的x 與s，其批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）應(yīng)不超過10.0%。待評(píng)價(jià)系統(tǒng)采用三批國(guó)產(chǎn)試劑盒分別測(cè)定同一批次低、中、高值質(zhì)量控制品，每批試劑盒各測(cè)10 孔，計(jì)算30 次測(cè)定結(jié)果的x 與s，3 個(gè)批號(hào)國(guó)產(chǎn)試劑盒的批間CV 應(yīng)不超過15.0%。

1.3.4 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)：參考PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)[2]，待評(píng)價(jià)系統(tǒng)和對(duì)比系統(tǒng)平行檢測(cè)66 例不同濃度的孕婦血清樣本，每個(gè)樣本測(cè)定1 次（樣本均先按試劑盒說明書稀釋5 倍后檢測(cè)，得到的結(jié)果乘以5 后為樣本的原始濃度），采用線性回歸方法對(duì)兩組結(jié)果進(jìn)行線性擬合，PAPP-A行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求兩組結(jié)果的r 應(yīng)不小于0.950，斜率應(yīng)在0.9 ～ 1.1 內(nèi)。并利用回歸方程進(jìn)行偏差估計(jì)，以預(yù)期偏差滿足國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（PAPP-A 靶值±30%）為接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.5 參考區(qū)間建立：參考C28-A2 要求[4]，待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)孕期在9 ～ 13+6周的2 519 例孕母血清樣本，建立PAPP-A 的參考區(qū)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2007 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以±s 表示；線性回歸采用最小二乘法進(jìn)行分析，并對(duì)r 采用t 檢驗(yàn)，tr＞ t0.05（v），P＜0.05，認(rèn)為2 個(gè)變量間具有相關(guān)性，r 的絕對(duì)值大于0.7，則表示2 個(gè)變量高度相關(guān)；r 的絕對(duì)值大于0.4，≤0.7 時(shí)，則表示2 個(gè)變量中度相關(guān)；r 的絕對(duì)值大于0.2，≤0.4 時(shí)，則表示2 個(gè)變量低度相關(guān)；2 組配對(duì)樣本定量結(jié)果的差異采用t 檢驗(yàn)，t ＜t0.05（v），P ＞ 0.05，表明差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同孕周PAPP-A 的參考區(qū)間計(jì)算，采用第5 和95 的百分位數(shù)表示，并計(jì)算其中位數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 檢出限 見表1。待評(píng)價(jià)系統(tǒng)重復(fù)測(cè)定零濃度校準(zhǔn)品20 次的反應(yīng)量的x 為943.15，s 為15.78，x+2s 為974.71，采用同步檢測(cè)校準(zhǔn)品得到的劑量-反應(yīng)曲線擬合，得到相應(yīng)濃度值為0.50 mIU/L，即為空白限。5 份近似25 mIU/L 的低值樣本檢測(cè)結(jié)果均未低于空白限。

表1 待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)PAPP-A 低值樣本的結(jié)果

2.2 線性 見 圖1。在9.00 ～2 530.00 mIU/L 范圍內(nèi)，實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的線性回歸方程為Y=0.998 0X+6.061 7，r=0.999 6，實(shí)測(cè)濃度與理論濃度呈高度正相關(guān)（tr=86.59, P＜0.05）。

圖1 待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)PAPP-A 的線性評(píng)價(jià)

2.3 精密度 見表2。待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)低值、中值和高值PAPP-A 質(zhì)量控制品的批內(nèi)CV 分別為2.86%，2.34%和2.80%；批間CV 分別為3.02%，2.98%和3.48%。

2.4 準(zhǔn)確度 待評(píng)價(jià)系統(tǒng)和對(duì)比系統(tǒng)平行檢測(cè)66 例孕母血清樣本的濃度結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.10，P ＞ 0.05），兩組數(shù)據(jù)的線性回歸方程為Y=0.937 3X+270.15，r=0.993 2，呈高度正相關(guān)（tr=96.68, P ＜0.05），結(jié)果見圖2。采用回歸方程進(jìn)行偏差估計(jì)，當(dāng)孕母血清樣本PAPP-A 濃度＞745 mIU/L 時(shí)，預(yù)期偏差均在靶值±30%范圍內(nèi)。

表2 待評(píng)價(jià)系統(tǒng)的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖2 待評(píng)價(jià)系統(tǒng)和對(duì)比系統(tǒng)檢測(cè)PAPP-A 結(jié)果的線性回歸分析

2.5 參考區(qū)間 見表3。待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)了9 ～ 13+6周 的2 519 例孕母血清 中 的PAPP-A，在9 ～ 9+6，10 ～ 10+6，11 ～ 11+6，12 ～ 12+6和13 ～ 13+6孕 周 的PAPP-A 中位數(shù)分別為 977，1 550，2 536，3 683和5 393 mIU/L。

表3 待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)PAPP-A 的參考區(qū)間

3 討論

檢測(cè)系統(tǒng)在用于實(shí)際檢測(cè)臨床樣本、發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告前，實(shí)驗(yàn)室必須在檢測(cè)系統(tǒng)最佳穩(wěn)定狀態(tài)下使用，對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的分析性能予以證實(shí)。血清學(xué)產(chǎn)前篩查對(duì)血清標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果有較高的準(zhǔn)確度和精密度要求，實(shí)驗(yàn)室需要使用符合要求的檢測(cè)產(chǎn)品。本研究參考PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)Auto TRFIA-4 型自動(dòng)熒光免疫分析儀和試劑盒檢測(cè)PAPP-A 進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)，空白限達(dá)到0.50 mIU/L，檢測(cè)限符合PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求；線性范圍達(dá)9.00～2 530.00 mIU/L，較PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求的線性范圍寬，其r 達(dá)到0.999 6；檢測(cè)PAPP-A 的批內(nèi)CV 小于3%，批間CV 小于4%，精密度優(yōu)于PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，在加拿大的技術(shù)規(guī)范中要求檢測(cè)PAPP-A的CV 不超過10%[5]，我國(guó)頒布的孕中期產(chǎn)前篩查技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求的產(chǎn)前篩查血清標(biāo)志物批內(nèi)CV 小于3%，批間CV 小于5%[6]；方法學(xué)比對(duì)試驗(yàn)為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)的方法之一，待評(píng)價(jià)系統(tǒng)和對(duì)比系統(tǒng)檢測(cè)PAPP-A 結(jié)果采用線性回歸方程分析，斜率為0.937 3，r 為0.993 2，符合PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，且兩系統(tǒng)檢測(cè)的PAPP-A 濃度結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.10, P＞0.05）。采用回歸方程進(jìn)行偏差估計(jì)，當(dāng)孕母血清樣本PAPP-A 濃度大于745 mIU/L 時(shí)，預(yù)期偏差均在國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（PAPP-A 靶值±30%）范圍內(nèi)。本研究參考C28-A2 要求[4]，建立了待評(píng)價(jià)系統(tǒng)檢測(cè)PAPP-A 的中位數(shù)，與高剛[7]等報(bào)道的臨沂地區(qū)8 426 例孕婦9 ～ 13+6周的PAPP-A 中位數(shù)比較，平均高18.38%，可能與不同檢測(cè)系統(tǒng)、不同地區(qū)受檢人群和入選樣本例數(shù)差異有關(guān)，蔣濤等[8]也曾報(bào)道了2 個(gè)不同地區(qū)的PAPP-A 中位數(shù)偏差平均可達(dá)14.3%，因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積累一定數(shù)據(jù)后，根據(jù)本地?cái)?shù)據(jù)建立自己的中位數(shù)，而后將所有實(shí)際測(cè)定值的濃度轉(zhuǎn)化為MOM 來表達(dá)，再使用標(biāo)化后的MOM值對(duì)篩查疾病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

綜上所述，國(guó)產(chǎn)Auto TRFIA-4 型自動(dòng)熒光免疫分析儀和試劑盒檢測(cè)PAPP-A 的性能符合PAPP-A 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，建立的PAPP-A 參考區(qū)間以供臨床參考。