劉麗華，葉賢林，程麗娜，聶湘輝,黃 璐，葉登凰，李 彤

（1.河源市中心血站，廣東河源 517000；2.深圳市血液中心，廣東深圳 518035)

隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatitis B virus infection ,OBI）定義為根據(jù)現(xiàn)有檢測方法機(jī)體HBsAg 檢測陰性，肝臟和/或血液存在HBV DNA的一種狀態(tài)，根據(jù)是否存在血清學(xué)標(biāo)記物抗-HBc和/或抗-HBs 分為血清學(xué)陽性O(shè)BI 與血清學(xué)陰性O(shè)BI[1]。OBI 可經(jīng)輸血或器官移植等方式傳播HBV，與慢性肝損傷或肝細(xì)胞癌有關(guān)；OBI 個體在免疫機(jī)能下降或處于免疫抑制狀態(tài)時可導(dǎo)致HBV 活化[2]。迄今為止國內(nèi)外已對OBI 在流行病學(xué)、發(fā)生機(jī)制、臨床意義等方面做了大量調(diào)查研究[2-5]，但廣東河源地區(qū)無相關(guān)報道。河源市中心血站自2016年1月1日起對所有獻(xiàn)血標(biāo)本在兩種酶免試劑檢測的基礎(chǔ)上增加了HBV，HCV，HIV 混合分項核酸檢測（nucleic acid test，NAT），篩查出了比其他地區(qū)更多的HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本，提示河源可能為OBI 流行地區(qū)，輸血安全受到嚴(yán)重威脅。為了解本地區(qū)獻(xiàn)血者OBI 的血清學(xué)及分子生物學(xué)流行特征，為輸血安全防控提供數(shù)據(jù)支撐，特對HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本進(jìn)行了多方法檢測和確認(rèn)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2016年1月1日～2018年5月31日河源市中心血站采集的47 021 例無償獻(xiàn)血者，所有獻(xiàn)血者經(jīng)體檢、乙肝表面抗原膠體金試紙條快速檢測、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)羅氏干式試紙條初篩及血紅蛋白初篩合格。采集無償獻(xiàn)血者EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本兩支，分別用于NAT（8 ml，帶分離膠）和ELISA，ALT（5 ml，不帶分離膠）檢測。所有無償獻(xiàn)血者都簽署知情同意書，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：深圳愛康Xantus44/OH-150 全自動加樣儀；UranusAE 268 全自動酶免儀；德國西門子BEPIII 全自動酶免分析儀；深圳邁瑞B(yǎng)S-420 全自動生化分析儀；上海浩源ChiTas BSS1200 全自動血液核酸檢測儀；美國ABI 7500 是實時熒光定量PCR 儀；美國羅氏Cobas E602 全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀；美國ABI9700 巢氏PCR 擴(kuò)增儀；德國Eppendorf5804 臺式離心機(jī)；美國AgilentMX3005P實時熒光定量儀；姜堰市新康醫(yī)療420B 電熱恒溫水浴鍋；北京百晶六一2502 水平式電泳儀；北京鼎國UV254 暗箱式紫外透射儀；上海山富Biotop5C810 凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 試劑：ELISA 檢測試劑：HBsAg 采用法國伯樂及珠海麗珠公司試劑；抗-HCV 采用北京萬泰及珠海麗珠公司試劑；HIV-Ag/Ab 采用法國伯樂及珠海麗珠公司試劑；抗-TP 采用北京萬泰及珠海麗珠公司試劑。ALT 的檢測采用邁瑞公司試劑。NAT采用上海浩源公司試劑。乙肝病毒血清標(biāo)志物定量采用羅氏公司試劑。病毒提取采用美國羅氏公司（High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit）試劑。HBV 病毒載量測定采用大連寶生物公司的Premix Ex Taq(Perfect Real Time)。血源篩查試劑均為國家檢定權(quán)威機(jī)構(gòu)批檢合格產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血清學(xué)檢測：采用2 個不同生產(chǎn)廠家的ELISA 試劑對所有研究對象標(biāo)本進(jìn)行HBsAg,抗-HCV,抗-TP 及HIV-Ag/Ab 檢測。如雙試劑或任一試劑S/CO ≥0.8，判為不合格；雙試劑S/CO＜0.8，判為合格。ALT 速率法檢測結(jié)果＞50U/L判為不合格。實驗室常規(guī)篩查HBsAg-/HBV DNA+的標(biāo)本外送第三方檢驗機(jī)構(gòu)廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司做電化學(xué)發(fā)光HBsAg,抗-HBs 定量及HBeAg,抗-HBe,抗-HBc 定性檢測。

1.3.2 核酸檢測：排除HBsAg,抗-HCV,抗-TP,HIVAg/Ab 及ALT 檢測不合格標(biāo)本，對ELISA 及ALT檢測結(jié)果合格的44 596 例標(biāo)本，采用上海浩源公司的ChiTas BSS1200 全自動血液核酸檢測儀以150 μl×8 混樣模式提取血漿標(biāo)本病毒核酸，進(jìn)行熒光PCR HBV，HCV，HIV 分項檢測，對混樣檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行單人份拆分檢測，拆分陽性判為不合格。對實驗室常規(guī)篩查HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本取2.5 ml 血漿做病毒核酸大容量提取，提取過程嚴(yán)格按照試劑說明書操作。目的基因擴(kuò)增及病毒載量測定方法參考文獻(xiàn)[6]。

1.3.3 進(jìn)化樹的構(gòu)建：在國際基因庫選取A～I(xiàn)基因型HBV 野毒株各3 例，用MEGA7.0 系統(tǒng)進(jìn)化軟件以鄰接法驗證復(fù)數(shù)1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.4 HBsAg-/HBV DNA+判定標(biāo)準(zhǔn)：2 個不同廠家ELISA 試劑及電化學(xué)發(fā)光試劑檢測HBsAg 結(jié)果均為陰性則判為HBsAg 確證陰性。對于上海浩源NAT HBV DNA 陽性的標(biāo)本，滿足以下2 種情況的任意一種即為HBV DNA 確證陽性：①巢式PCR S片段或者BCP 片段其中1 個陽性; ②實時熒光定量PCR（qPCR）陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，分類變量資料采用χ2檢驗，連續(xù)變量資料中兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗采用Mann-Whitney U 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OBI 總體檢出情況 2016年1月1日～2018年5月31日 共 對44 596 例ELISA 及ALT 合格標(biāo)本進(jìn)行NAT，檢出浩源HBV DNA 陽性標(biāo)本83 例，其中3 例電化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg 陽性，為無癥狀慢性感染，69 例確認(rèn)HBsAg-/HBV DNA+。其中1 例血清學(xué)標(biāo)志物全陰，為窗口期感染；其余68例血清學(xué)標(biāo)志物抗-HBc 或抗-HBs 陽性，確認(rèn)為OBI，OBI 檢出率為0.15%(68/44 596，1∶656)。

68 例OBI 獻(xiàn)血者包括男性59 例（86.8%），女性9 例（13.2%）；初次獻(xiàn)血者40 例（58.8%），重復(fù)獻(xiàn)血者28 例（41.2%）；河源籍57 例（83.8%），非河源籍11 例（16.2%）。OBI 檢出率男性高于女性，初次獻(xiàn)血者高于重復(fù)獻(xiàn)血者，河源籍高于非河源籍，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡段OBI 檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,其中 18～26 歲組檢出率最低，隨年齡增長檢出率增高。見表1。

表1 OBI 在不同性別、年齡及獻(xiàn)血次數(shù)的獻(xiàn)血者中的分布特征

2.2 OBI 血清學(xué)標(biāo)志物檢測情況 OBI 血清學(xué)模式見表2，其中抗-HBs-抗-HBc+ 40 例（58.8%），抗-HBs+抗-HBc+ 27例（39.7%），抗-HBs+抗-HBc-1 例（1.5%）。抗-HBs 定量38 例（55.9%）小于10 IU/L，21例（30.9%）為10～100 IU/L，9例（13.2%）大于100 IU/L。不同血清學(xué)模式抗-HBs 定量分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 OBI 獻(xiàn)血者血清學(xué)標(biāo)志物模式（n=68）

表3 不同血清學(xué)模式OBI 抗-HBs 濃度及病毒載量分布情況

2.3 OBI 病毒載量測定情況 見表3。68 例OBI標(biāo)本，10 例不可定量，其余58 例（85%）獲得定量結(jié)果，病毒載量范圍為1.08～1 383.93IU/ml(中位數(shù)34.38 IU/ml)，見圖1。不同血清學(xué)模式病毒載量分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 OBI PCR 檢測及基因分型情況 見表4。聯(lián)合巢式PCR BCP 區(qū)，S 區(qū)擴(kuò)增及qPCR 對實驗室常規(guī)NAT 檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，其中三項檢測結(jié)果均為陽性23 例（33.8%），任意兩項陽性48 例（70.6%），任意一項陽性68 例（100%）。43 例可分型的OBI 標(biāo)本中，B 基因型41 例（95.3%），C 基因型2 例（4.7%）。

圖1 OBI 病毒載量分布圖

表4 巢式PCR 聯(lián)合qPCR 檢測情況（n=68）

3 討論

OBI 作為HBV 感染的一種特殊形式，其流行率根據(jù)HBV 流行病學(xué)特點在不同的地理區(qū)域和人群之間存在差異。此外，研究所用的檢測方法及其特異度和敏感度，選擇的被檢測材料（例如原樣管血漿、血袋漿）等均影響OBI 的檢出率。我國2 個由國家臨床檢驗中心組織的涉及826 044和1 205 796 標(biāo)本量的跨越南北多中心聯(lián)合調(diào)查研究顯示OBI 的檢出率分別為0.08%(1:1 200)和0.07%(1:1 527)[7-8]。河源地區(qū)獻(xiàn)血人群OBI 檢出率為0.15%(1:656)，高于上述全國平均水平，同時高于同為粵北的韶關(guān)（0.09%,1:1 126）[9],低于深圳（0.22%，57/26 263）[6]。本研究在實驗室常規(guī)篩查方法的基礎(chǔ)上分別采用靈敏度更高的電化學(xué)發(fā)光法、巢式PCR 及qPCR 對HBsAg-/HBV DNA+標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn),已最大程度降低了假陽性對OBI 檢出率的干擾。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示河源籍OBI 檢出率為0.186%，非河源籍OBI 檢出率0.078%，與全國平均水平相當(dāng)，說明河源地區(qū)OBI 檢出率偏高的主要原因為河源當(dāng)?shù)豀BV 感染基數(shù)較高。我國總體獻(xiàn)血人群獻(xiàn)血后ELISA 檢測陽性率為0.7%[7]，而河源地區(qū)獻(xiàn)血人群獻(xiàn)血后ELISA 檢測陽性率為1.11%[10]，遠(yuǎn)高于全國平均水平，也提示河源地區(qū)HBV 感染基數(shù)較高。深圳獻(xiàn)血人群HBsAg 陽性率低于河源，而同期OBI 檢出率卻比河源高[6]，在兩研究對HBsAg 和HBV DNA 確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)及OBI 判定標(biāo)準(zhǔn)一致的基礎(chǔ)上，分析主要原因為兩地采用的NAT 體系靈敏度有差異，深圳采用靈敏度較高的第二代單人份檢測體系，而河源采用的是8 樣本混合檢測體系。若河源地區(qū)采用單人份NAT 體系，預(yù)計OBI 檢出率將高于深圳報道的0.22%。這提示目前河源地區(qū)采用的8 樣本混合檢測體系存在較高的OBI 血液漏檢風(fēng)險，應(yīng)選用靈敏度更高的單人份NAT 系統(tǒng)以進(jìn)一步提高OBI 標(biāo)本的檢出率，降低經(jīng)輸血傳播HBV 風(fēng)險。

與嘉興地區(qū)[11]報道的相同，本研究OBI 檢出率在不同性別、年齡及獻(xiàn)血次數(shù)人群間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），男性高于女性，初次獻(xiàn)血者高于重復(fù)獻(xiàn)血者，并隨年齡增長檢出率增高，其中18～26 歲組檢出率最低。1992年我國把乙肝疫苗納入免疫規(guī)劃，18～26 歲年齡段人群為計劃免疫后出生群體，推測乙肝疫苗的接種降低了該年齡段獻(xiàn)血人群HBV 感染的風(fēng)險，與葉賢林、HSU[6，12]等研究結(jié)論相符。OBI 檢出率隨年齡增長而增高，提示長期反復(fù)暴露在HBV 環(huán)境中是導(dǎo)致OBI 的一個重要原因。CANDOTTI 等[13]表示除了撒哈拉以南非洲地區(qū)外，OBI 獻(xiàn)血者的年齡趨向于45 歲以上，表明OBI 處于慢性HBV 攜帶后期。本研究統(tǒng)計OBI 獻(xiàn)血者年齡范圍為20～56 歲（中位年齡38.5 歲，平均年齡39 歲），不足以說明OBI 處于慢性HBV攜帶后期的觀點。國內(nèi)報道的OBI 獻(xiàn)血者相對年輕，如江蘇平均36.9 歲[14]、福建平均37.4 歲[15]。有觀點認(rèn)為非洲與東南亞地區(qū)HBV 主要通過母嬰垂直傳播或者在幼童時期感染，而歐洲地區(qū)HBV 的感染主要是在15 歲后通過毒品注射或性傳播，因此發(fā)展為OBI 的年齡也相對較大[16]40。此外，不同區(qū)域OBI 感染者的年齡差異是否與不同區(qū)域間基因型差異有關(guān)有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測結(jié)果顯示河源地區(qū)OBI 獻(xiàn)血者絕大多數(shù)（98.5%）是以抗-HBc 陽性為主的血清學(xué)陽性O(shè)BI，1 例(1.5%)單獨抗-HBs 陽性。在血清學(xué)陽性的OBI 獻(xiàn)血者中，HBsAg 可能在急性HBV 感染自限性恢復(fù)后或慢性HBV 感染數(shù)十年后變?yōu)殛幮浴？?HBc 與HBV 的自然感染有關(guān)，存在于免疫能力正常個體慢性感染的全過程，即使在感染康復(fù)后依然持續(xù)存在，常作為OBI 的替代檢測標(biāo)記。1 例單獨抗-HBs 陽性獻(xiàn)血者出生于實行計劃免疫后的1994年，可能為疫苗突破性感染。

澳大利亞SEED 等[17]經(jīng)過回顧性分析認(rèn)為絕大多數(shù)與OBI 血液相關(guān)的輸血感染抗-HBs 均不高于10 IU/L。國內(nèi)外均有報道認(rèn)為血液中抗-HBs 大于100 IU/L 時，血液是相對安全的[18],[16]190-199。日本則認(rèn)為對于抗-HBc 陽性的血液，抗-HBs 大于或等于200 IU/L 才相對安全[16]190-199。本研究59 例（86.8%）OBI 獻(xiàn)血者抗-HBs 定量小于100 IU/L，38 例（55.9%）小于10 IU/L，提示有較高的經(jīng)輸血傳播HBV 風(fēng)險。當(dāng)然，OBI 經(jīng)輸血傳播HBV 的概率應(yīng)綜合考慮獻(xiàn)血者、受血者雙方的抗體水平，受血者免疫狀態(tài)、輸入血漿的量以及血液病毒載量等因素。

對河源地區(qū)OBI 標(biāo)本進(jìn)行病毒載量測定顯示其中10 例不可定量，其余58 例病毒載量中位數(shù)為34.38 IU/ml，與報道的中位數(shù)通常在10 ～50IU/ml相符[13]。血液中HBV DNA 的持續(xù)低水平復(fù)制是OBI 的一大特點，急性或慢性HBV 感染后HBsAg消失所致OBI 血清HBV DNA 水平通常很低[19]；HBV S 基因剪接突變所致的OBI 病毒載量低或檢測不到，S 基因逃逸突變或啟動子突變所致OBI 病毒載量與顯性感染者相當(dāng)[1]。推測本研究中3 例病毒載量大于1 000 IU/ml 獻(xiàn)血者，可能為S 基因逃逸突變或啟動子突變所致。經(jīng)統(tǒng)計，抗-HBs 陽性O(shè)BI 獻(xiàn)血者病毒載量明顯低于抗-HBs 陰性O(shè)BI 獻(xiàn)血者(U=333.000, P=0.008)。結(jié)合該統(tǒng)計數(shù)據(jù)，針對目前受到廣泛關(guān)注的單檢鑒別陰性或混檢拆分陰性標(biāo)本仍存在HBV殘存風(fēng)險的問題，若引入抗-HBc及抗-HBs 檢測，淘汰抗-HBc+/抗-HBs-標(biāo)本應(yīng)能進(jìn)一步降低HBV 殘存風(fēng)險。

本研究聯(lián)合巢式PCR S 區(qū)，BCP 區(qū)擴(kuò)增及qPCR對實驗室常規(guī)NAT檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行確認(rèn)，其中三項檢測結(jié)果均為陽性23 例（33.8%），任意兩項陽性48 例（70.6%），任意一項陽性68 例（100%），提示聯(lián)合多種檢測方法可以提高OBI檢出率?；蚍中惋@示95.3%（41/43）為B 基因型，4.7%（2/43）為C 基因型，2 例C 基因型獻(xiàn)血者戶籍分別為河南省與山東省，符合我國南方HBV 以B 型為主的分布規(guī)律[20]。

綜上所述：河源地區(qū)獻(xiàn)血人群OBI 檢出率相對較高，以B 基因型為主。應(yīng)選用靈敏度更高的單人份核酸檢測系統(tǒng)以進(jìn)一步提高OBI 標(biāo)本的檢出率，降低經(jīng)輸血傳播HBV 風(fēng)險。