駱時木,葉宇宸,歐陽航,蔣燕成,張志珊（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院檢驗科,福建泉州 362000）

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是目前嚴(yán)重威脅人類健康的主要慢性病，同時也是危害大眾健康的主要疾病，預(yù)計2035年患有2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）的人群將達到5.92 億[1]。轉(zhuǎn)錄因子7 類似物2（transcription factor 7 like 2，TCF7L2）基因位于人類第10 號染色體長臂25 區(qū)3帶上，全長215.9bq，具有17 個外顯子，編碼著一個高遷移率的轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2(又名TCF-4）。該轉(zhuǎn)錄因子主要表達于人的胰島β 細(xì)胞和脂肪組織中，是Wnt 信號通路的重要組成部分，在β 細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)中起中心作用[5]，影響脂代謝、胰島素分泌和胰島素抵抗[6]。研究顯示TCF7L2 基因與T2DM 相關(guān)[2-4]。北京LUO 等[7]做的東亞人群Meta分析證實TCF7L2 基因的rs7903146，rs11196205，rs12255372 以及rs290487 位點與T2DM 均顯著相關(guān)。但 關(guān) 于TCF7L2 rs11196205基因多態(tài)性與T2DM 的相關(guān)性的研究說法不一。本次研究旨在分析福建泉州地區(qū)漢族人群TCF7L2 rs11196205 多態(tài)性與T2DM 的相關(guān)性，以期為T2DM 的個體化診斷與治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本次的研究對象為福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院臨床患者和健康體檢人群，共300例。其中健康對照組100 例中男性53 例，女性47 例，平均年齡53.35±10.96 歲；T2DM 組200 例中男性121 例，女性79 例，平均年齡57.73±11.76 歲。其診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1999年世界衛(wèi)生組織的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和1999年10月我國糖尿病學(xué)會的中國人群糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡入選對象主要為來自福建泉州地區(qū)的漢族人群，無血緣關(guān)系。排除肝臟疾病、腎病綜合征、甲狀腺或腎上腺疾病等影響血脂代謝疾病，且近1 個月內(nèi)未使用降脂藥物。

1.2 儀器與試劑 HbAlc 檢測試劑盒，HA8180 糖基化血紅蛋白儀（日本愛科來公司）；生化測定試劑盒，AU5800 全自動生化儀（美國貝克曼公司）；全血DNA 提取試劑盒（美國Qiagen 公司）；引物合成和Taq 聚合酶[TaKaRa 寶生物工程（北京）有限公司]；PCR 擴增儀（德國Eppendorf 公司）；Gel Doc XK 凝膠成像儀（美國BIO-RAD 公司）。

1.3 方法 所有研究對象均禁食12 ～14 h 后，于次日清晨采肘靜脈血2 管。一管用EDTA-K3抗凝，采用高效液相色譜法檢測HbAlc 后，全血DNA 提取試劑盒進行 DNA 樣本的提取。BioTeke 濃度檢測儀檢測其DNA 濃度及純度，在NCBI 數(shù)據(jù)庫上下載目標(biāo)SNP 位點上下500bp 的基因序列。采用引物設(shè)計軟件Primer premier5.0 設(shè)計下列引物：F：5’-TATTGTTGGGTCTTTAGATTGTC-3，R：5’-ATTTCGTTTGCCTGTTTTGA-3’。對DNA 樣品進行PCR 擴增，用3%的瓊脂糖凝膠檢測擴增產(chǎn)物。北京六合華大基因科技有限公司進行測序，Chromas 軟件分析測序結(jié)果。另一管促凝，完全凝固后2h 內(nèi)以3 000 r/min 離心5min 分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清中GLU，TC，TG，HDL-C，LDL-C，ApoA 和ApoB 等7 項生化指標(biāo)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0 軟件進行分析，所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對于符合正態(tài)分布的計量資料兩樣本的比較采用獨立樣本t 檢驗。計數(shù)資料采用四格表或R×C 表的卡方檢驗?；蝾l率采用基因計數(shù)法計算。等位基因確認(rèn)符合Hardy-Weinberg 平衡。 基因型和等位基因頻率的比較采用卡方（χ2）檢驗。以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCF7L2 rs11196205基因測序 PCR擴增后TCF7L2 rs11196205 基因片段為407 bp，將其DNA測序結(jié)果與Gene Bank 參考序列對比。結(jié)果顯示rs11196205 位點存在兩種：GG 基因型和GC 基因型，未發(fā)現(xiàn)CC 基因型，見圖1。

圖1 TCF7L2 基因 rs11196205 位點

2.2 TCF7L2 rs11196205基因多態(tài)性與T2DM 的關(guān)聯(lián)分析 對照組、T2DM 組人群TCF7L2 基因rs11196205 位點多態(tài)性分布情況均符合 Hardy-Weinberg 平衡（P ＞0.05）。所研究的基因型頻數(shù)和預(yù)期的基因型頻數(shù)相符合，具有群體代表性（對 照 組χ2=0.222, P=0.637；T2DM 組χ2=0.023,P=0.879）。

T2DM 組GC 型基因分布頻率（3.0%）低于正常對照組（9.0%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.053，P=0.025）。T2DM 組C等位基因頻率（1.5%）低于正常對照組（4.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.923，P=0.027），見表1。TCF7L2基因rs11196205 基因型分布頻率在正常對照組和T2DM 組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 TCF7L2 基因rs11196205 基因分布頻率[n(%)]

2.3 TCF7L2 rs11196205 不同基因型糖化血紅蛋白與生化指標(biāo)水平對比 見表2。對照組與T2DM 組GG 和GC 不同基因型HbAlc 與8 種生化指標(biāo)水平的結(jié)果比較，其中對照組GC 基因型HbAlc 水平低于GG 基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031）。其余生化指標(biāo)在不同基因型間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。同時，T2DM 組中GG 和GC 不同基因型間HbAlc 與生化指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

表2 TCF7L2 基因rs11196205 不同基因型生化指標(biāo)比較

2.4 T2DM 危險因素的二分類Logistic 回歸分析 見表3。將全部研究對象作為整體進行二分類Logistic 回歸分析，是否有2 型糖尿病（否為0，有為1）作為因變量（Y），其他指標(biāo)作為自變量（X）。分析結(jié)果如下：BMI，HbAlc，GLU 是本研究對象中發(fā)生T2DM 的獨立危險因素，而rs11196205 基因型不是發(fā)生T2DM 的獨立危險因素。

表3 T2DM 危險因素 Logistic 回歸分析

3 討論

多項研究表明T2DM 的發(fā)病機理與遺傳、肥胖、胰島β 細(xì)胞功能紊亂[8]、炎癥[9]、氧化應(yīng)激、腸道因素等多因素有關(guān)。在眾多因素中，遺傳在T2DM發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。近年來，與T2DM 相關(guān)的基因多態(tài)性的研究成為熱點，其中TCF7L2 基因的研究最多。

本次研究以福建泉州地區(qū)漢族人群為研究對象，應(yīng)用PCR 基因測序技術(shù)，對對照組和T2DM組TCF7L2 rs11196205 基因多態(tài)性分布進行分析。TCF7L2 基因rs11196205 位點共檢測到15 個GC 雜合型突變，突變率為5%(15/300)，C 等位基因頻率為2.5%（15/600）。張潔等[10]研究福建地區(qū)漢族人群rs11196205 位點C 等位基因頻率為1.4%，和我們的結(jié)果接近。

研究結(jié)果顯示T2DM 組GC 基因型及C 等位基因的分布頻率均低于對照組，提示GG 和GC 基因型在不同組間的分布存在顯著差異，且C 等位基因有可能降低T2DM 的患病風(fēng)險。鐘愛麗[11]研究表明rs11196205 基因型與延邊地區(qū)漢族T2DM發(fā)病有較強相關(guān)性，與我們的結(jié)果一致。并推測C位點可能是T2DM 和高血壓的保護因子，可通過影響胰島素水平，抑制肥胖等途徑降低罹患T2DM和高血壓風(fēng)險。張江峰等[12]研究發(fā)現(xiàn)該位點與重慶地區(qū)漢族人群T2DM 發(fā)病相關(guān)，但考慮到rs11196205 位點風(fēng)險等位基因在中國人群中屬低頻分布，故其在中國人群T2DM 的發(fā)病過程中可能不起顯著作用。而國外GRAVAND 等[13]研究則認(rèn)為伊朗西南部人群TCF7L2 rs11196205 多態(tài)性與T2DM 風(fēng)險無關(guān)。

除了遺傳因素，T2DM 的發(fā)生發(fā)展還與其他多種因素相關(guān)。本研究Logistic 回歸結(jié)果顯示，BMI，HbAlc，GLU 是T2DM 的獨立危險因素，而rs11196205 基因型并不是發(fā)生T2DM 的獨立危險因素，需要其它因素的協(xié)同作用。

HUERTAS-VAZQUEZ 等[14]人研究 TCF7L2 基因 rs7903146，rs12255372 多態(tài)性對血脂水平的影響。結(jié)果顯示rs7903146，rs12255372 多態(tài)性可引起墨西哥及芬蘭人群血清三酰甘油水平的升高。國內(nèi)趙曉宇等[15]報道在中國北方人群中 TCF7L2 rs11196218 AG 與血脂異常相關(guān)。朱暉等[16]發(fā)現(xiàn)安徽地區(qū)漢族人群rs11196205 和T2MD 相關(guān)，且基因多態(tài)性與糖代謝相關(guān)。本研究結(jié)果顯示正常對照組rs11196205 位點GC 基因型的HbAlc 水平低于GG 基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此我們推測TCF7L2 rs11196205 C 等位基因可能通過下調(diào)血糖降低T2DM 的患病風(fēng)險。當(dāng)然，考慮到本研究入組的標(biāo)本量較少，可能存在抽樣誤差，我們將進一步擴大樣本進行分析。