王玉雙，李一路，程 偉，張 敏*，郭照輝，雷 平，單世平，付祖姣，易紅偉，楊 迪

（1.湖南省微生物研究院，長(zhǎng)沙 410009；2.湖南雙紅農(nóng)科生態(tài)工程有限公司，長(zhǎng)沙410205；3.益陽(yáng)欣博農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，益陽(yáng) 413002）

根際有益微生物因可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，降低植物對(duì)病蟲(chóng)害的感染，已經(jīng)在農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其能夠成功應(yīng)用并發(fā)揮作用的重要前提在于能成功存活和定殖，該過(guò)程受復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境影響[1-3]。趨化性是指微生物對(duì)多種化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度產(chǎn)生趨向或離避響應(yīng)的行為，是微生物為適應(yīng)環(huán)境而自我保護(hù)的一種基本屬性[4]。已有大量研究表明，趨化作用有助于根際微生物在根際的定殖[5-7]。趨化作用的產(chǎn)生與植物根系在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的根系分泌物密切相關(guān)。根系分泌物中的糖類(lèi)、氨基酸、小分子有機(jī)酸等都可作為特定的信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)根際微生物的趨化，進(jìn)而促進(jìn)其在植物根際的定殖[8-11]。Tan等[12]研究表明，番茄根系分泌的有機(jī)酸，尤其是蘋(píng)果酸，可顯著誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌T-5（Bacillus subtilisT-5）的趨化作用。Ankati等[13]發(fā)現(xiàn)，花生根系分泌物中的肉豆蔻酸、硬脂酸和棕櫚酸對(duì)假單胞菌RP2（Pseudomons adaceaeRP2）在花生根際的定殖有正向影響。沈怡雯等[14]研究表明，西瓜根系分泌物中氨基酸組分能明顯促進(jìn)多黏類(lèi)芽孢桿菌SQR-21（Paenibacillus polymyxaSQR-21）在西瓜根際的定殖。

水稻是我國(guó)主要的糧食作物，極易富集鎘，稻米中吸收的鎘可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康[15-16]。如何降低水稻對(duì)土壤中鎘的吸收已成為一個(gè)長(zhǎng)期的研究熱點(diǎn)。目前鮮有報(bào)道通過(guò)微生物的趨化性來(lái)達(dá)到促進(jìn)水稻生長(zhǎng)及降低水稻鎘污染的研究。本研究擬開(kāi)展相關(guān)工作，已從水稻根際土壤中分離出一株耐鎘菌株134，初步鑒定為氣單胞菌（Aeromonassp.），其對(duì)鎘的耐受性可達(dá)75 mg/L。以水稻根系分泌物中的常見(jiàn)氨基酸組分和糖類(lèi)為趨化劑，考察菌株134對(duì)不同組分的趨化性，最后通過(guò)水培試驗(yàn)考察外源添加趨化劑對(duì)菌株134在水稻根際定殖的影響，以期獲得可高效誘導(dǎo)菌株134在水稻根際定殖的趨化劑，為開(kāi)發(fā)利用有效的微生物肥料提供理論支撐，為水稻鎘污染治理提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株

水稻品種為湘晚秈13號(hào)（Xiangwanxian 13），其種子購(gòu)于湖南省水稻研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

BHIS（brain heart infusion supplemented）液體培養(yǎng)基、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液、趨化緩沖液都根據(jù)文獻(xiàn)[14]來(lái)配置。趨化劑標(biāo)準(zhǔn)品（組氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖）和牛心腦浸液培養(yǎng)基均購(gòu)于長(zhǎng)沙鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻苗培育

水稻種子用70%乙醇消毒15 min，用去離子水清洗3遍，均勻鋪至帶孔盆內(nèi)，然后用濕紗布覆蓋，置于溫度為30℃、濕度為50%的人工氣候培養(yǎng)箱中培育，待種子發(fā)芽長(zhǎng)至1 cm左右，移栽至水培盒內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)。

1.2.2 耐鎘菌株的分離純化

從湘潭鎘污染水稻田中取水稻根際土制成土壤懸液，用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?.1 mL涂布在預(yù)先已加入CdCl2的細(xì)菌平板上，30℃下恒溫培養(yǎng)1～2 d，挑取單菌落，經(jīng)多次劃線(xiàn)、分離純化獲得純菌株。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將純化后的菌株在細(xì)菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)特征，注意其形狀、大小、顏色等，并作記錄。

1.2.3.2 生理生化鑒定

按照東秀珠等[17]編著的《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析

取純菌株134對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液1 mL，離心并收集菌體，用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取總DNA，采用細(xì)菌通用引物（27F和1492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，利用BLAST軟件將所測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的序列進(jìn)行同源性比較，并采用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[18]。

1.2.4 菌株134對(duì)外源趨化劑的趨化研究

1.2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考郝文雅等[19]的研究，選取水稻根系分泌物中存在的氨基酸（蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、組氨酸）和糖類(lèi)（果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖）進(jìn)行趨化試驗(yàn)分析。試驗(yàn)前配置濃度分別為0、40、60、80和100 μmol/L的各趨化劑標(biāo)準(zhǔn)液，過(guò)濾除菌后備用。

1.2.4.2 趨化作用定性分析

參照Grimm等[20]的滴定分析法，并作適當(dāng)修改。將活化好的菌株134種子液按1%的接種量接入BHIS液體培養(yǎng)基中，搖床（30℃、170 r/min）振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm=0.8）。取50 mL發(fā)酵液于室溫5 000 r/min離心，收集菌體并重懸于12 mL趨化緩沖液中，再加入4 mL 1%的羥丙基甲基纖維素制成菌懸液，充分混勻后倒入直徑為6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿約4 mL。然后向培養(yǎng)皿正中央分別滴入10 μL各趨化劑標(biāo)準(zhǔn)液并在室溫條件下靜置30 min，觀察培養(yǎng)皿中央趨化圈的變化情況。以添加趨化緩沖液作為對(duì)照組。

1.2.4.3 趨化作用定量分析

本文采用類(lèi)毛細(xì)管試驗(yàn)法[21]，在BHIS液體培養(yǎng)基中接種過(guò)夜活化好的菌株134種子液，30℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600nm=0.8），將發(fā)酵液于室溫5 000 r/min離心后重懸于等體積趨化緩沖液中制成菌懸液，用移液槍吸取100 μL菌株134菌懸液置于無(wú)菌操作臺(tái)中備用。用1 mL注射器作為試驗(yàn)用毛細(xì)管，分別吸取100 μL不同濃度（0、40、60、80 和 100 μmol/L）的趨化劑標(biāo)準(zhǔn)液，將注射器針頭插入上述移液槍頭的細(xì)口端，使趨化劑標(biāo)準(zhǔn)液與菌懸液充分接觸并靜置2 h。小心取出注射器針頭，對(duì)注射器中的趨化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液采用平板稀釋涂布法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，以趨化緩沖液作為對(duì)照，計(jì)算3個(gè)重復(fù)平板菌落數(shù)的平均值。趨化性指數(shù)（relative chemotaxis indix，RCI）值為處理組菌落形成單位（colony forming units，CFU）的平均值與相應(yīng)對(duì)照組CFU的比值，有研究表明，當(dāng)RCI大于2.00時(shí)即可認(rèn)為處理的趨化性與對(duì)照相比差異顯著[14]。

1.2.5 外源添加趨化劑對(duì)菌株134在水稻定殖的影響

本試驗(yàn)中水稻采取水培的模式進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌株134離心重懸于水培盒營(yíng)養(yǎng)液中，使其終濃度約為106CFU/mL，并充分混勻。將培養(yǎng)至4片葉的水稻幼苗根系在趨化劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中浸泡后移栽至水培盒，對(duì)照以趨化緩沖液代替，每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。將水培盒置于28℃人工氣候培養(yǎng)箱（光照16 h/黑暗8 h）中培育3 d，然后收集水稻根系并對(duì)根際定殖的菌株134進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

該試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)處理及繪圖采用Microsoft Excel（2003）軟件完成，各處理間的方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

經(jīng)濃度梯度培養(yǎng)分離，篩選出一株在液體細(xì)菌培養(yǎng)基中耐鎘質(zhì)量濃度為75 mg/L的菌株134，該菌株菌落形態(tài)為圓形，直徑為1～3 mm，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色為陰性（圖1）。

對(duì)分離菌134進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。該菌株接觸酶和氧化酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，且甘露醇、葡萄糖、水楊素、N-乙酰葡萄糖胺、D-核糖、麥芽糖、葵酸鹽、戊酸鹽、乙酸鹽、組氨酸、L-丙氨酸、糖原、L-脯氨酸和L-絲氨酸試驗(yàn)反應(yīng)也均為陽(yáng)性。對(duì)該菌進(jìn)行溶血試驗(yàn)觀察，結(jié)果為陰性。

以菌株134的總DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增并經(jīng)測(cè)序和Blast比對(duì)，選取與其同源性高的16S rDNA序列，利用MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。由結(jié)果可以看出，氣單胞菌屬（Aeromonas）與菌株134序列同源性最高，再接合形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果，可初步鑒定此分離菌株134為氣單胞菌。

圖1 菌株 134的菌落（a）及形態(tài)表征（b）Fig.1 Colony(a)and morphology(b)characterization of strain 134

2.2 菌株134對(duì)不同氨基酸組分的趨化性研究

滴定分析法定性試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)量試驗(yàn)過(guò)程中培養(yǎng)皿中形成的透明圈的大小來(lái)表示。有透明圈的產(chǎn)生就說(shuō)明菌株134在試驗(yàn)過(guò)程中向培養(yǎng)皿中心的趨化劑標(biāo)準(zhǔn)液游動(dòng)，即產(chǎn)生了趨化作用。結(jié)果如表2所示，菌株134對(duì)這5種氨基酸均表現(xiàn)出趨化性，其中對(duì)組氨酸的趨化性最強(qiáng)，亮氨酸和丙氨酸次之。

選擇效果明顯的3類(lèi)氨基酸進(jìn)行不同濃度的類(lèi)毛細(xì)管定量試驗(yàn)，結(jié)果表明（圖3），菌株134對(duì)各個(gè)濃度的組氨酸均表現(xiàn)出明顯的趨化性，RCI均大于 2.00，當(dāng)其濃度為 40 μmol/L 時(shí)，RCI值達(dá)到 7.20，趨化作用最強(qiáng)。當(dāng)亮氨酸濃度為80 μmol/L及以上時(shí)，菌株134表現(xiàn)出明顯的趨化性，尤其是濃度為80 μmol/L時(shí)，其 RCI值達(dá)到 4.90，低濃度時(shí)菌株134的趨化性較弱。當(dāng)丙氨酸的濃度為中等濃度（40～60 μmol/L）時(shí)可以誘導(dǎo)菌株 134 一定的趨化性，RCI值為 2.25～2.57。

2.3 菌株134對(duì)不同糖類(lèi)的趨化性研究

滴定分析法定性試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），除蔗糖外，菌株134對(duì)葡萄糖、麥芽糖及果糖均表現(xiàn)出明顯的趨化性。菌株134對(duì)葡萄糖和果糖的趨化性較強(qiáng)，其次為麥芽糖。選擇這3種糖類(lèi)進(jìn)行不同濃度的類(lèi)毛細(xì)管定量試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，菌株134對(duì)各個(gè)濃度的葡萄糖和果糖均表現(xiàn)出明顯的趨化性，RCI均大于2.00。不同的是，菌株134對(duì)葡萄糖的趨化強(qiáng)度隨葡萄糖濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，濃度為 60～80 μmol/L 時(shí)，RCI值達(dá)到 7.00 以上。而菌株134對(duì)果糖的趨化強(qiáng)度隨濃度升高幾乎都呈上升趨勢(shì)。當(dāng)果糖濃度為100 μmol/L時(shí)，RCI值達(dá)到5.00。當(dāng)麥芽糖的濃度為40 μmol/L時(shí)可以誘導(dǎo)菌株134一定的趨化性，RCI值為2.47，當(dāng)其濃度繼續(xù)上升時(shí)，菌株134表現(xiàn)出的趨化性很弱，RCI值都小于2.00。

表1 分離菌株134主要生化特征檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Main biochemical characteristics test results of the isolate 134

圖2 分離菌株134的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of the isolate 134

表2 菌株134對(duì)氨基酸和糖類(lèi)的趨化性Tab.2 Chemotaxis of strain 134 to amino acids and sugars

2.4 外源趨化劑對(duì)菌株134在水稻根際定殖的影響

由前面的趨化性試驗(yàn)結(jié)果可以看出，菌株134對(duì)組氨酸、亮氨酸、葡萄糖及D-果糖具有較強(qiáng)的趨化性，選擇這4種趨化組分及其趨化效果最強(qiáng)的濃度（分別為 40、80、60 及 100 μmol/L）設(shè)計(jì)水培試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證外源趨化劑對(duì)菌株134在水稻根際定殖的影響。計(jì)數(shù)結(jié)果如圖5所示，這4種趨化組分均能促進(jìn)菌株134在水稻根際的定殖，除組氨酸外，其他3組處理與對(duì)照均存在顯著差異（P<0.05），尤其是葡萄糖和果糖的處理，與對(duì)照相比差異極顯著（P<0.01）。亮氨酸、組氨酸、葡萄糖及D-果糖這4種 趨化組分處理的根際定殖細(xì)菌數(shù)量分別為對(duì)照的2.29、1.32、3.48及 3.87倍。

圖3 菌株134對(duì)不同濃度氨基酸的趨化反應(yīng)Fig.3 Chemotactic response of strain 134 toward different cocentrations of amino acids

圖4 菌株134對(duì)不同濃度糖類(lèi)的趨化反應(yīng)Fig.4 Chemotactic response of strain 134 toward different cocentrations of sugars

圖5 根系浸潤(rùn)不同趨化劑后菌株134在水稻根際的定殖數(shù)量Fig.5 The population levels of strain 134 recruited by rice roots after adding different chemotacticum to the rhizosphere

3 討論

根際有益微生物在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中擁有極大的潛能，其發(fā)揮作用的前提是能夠在植物根際中成功定殖。根際微生物的定殖能力不僅與自身特性相關(guān)，更是受植物根系分泌物的影響[22]。植物根系分泌物含有豐富的有機(jī)物質(zhì)，如氨基酸、糖類(lèi)、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)及次級(jí)代謝產(chǎn)物。這些有機(jī)物質(zhì)不僅能為土壤微生物的生長(zhǎng)和寄生提供豐富的養(yǎng)分，同時(shí)還可以作為信號(hào)分子調(diào)控土壤微生物之間或者微生物與寄主之間的互作[3,7]。已有大量研究表明，根系分泌物在根際微生物定殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。如Susana 等[23]發(fā)現(xiàn)，假單胞菌 SR1（Pseudomons adaceaeSR1）在小麥和玉米的根系定植可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增產(chǎn)并且可降低施肥量。Cao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌SQR9（Bacillus subtilisSQR9）在黃瓜根際定殖中可以抑制黃瓜根際尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的生長(zhǎng)，保護(hù)寄主免受病原菌的侵害。而目前關(guān)于水稻根系分泌物-根際有益微生物-水稻重金屬抗性的研究報(bào)道很少。本文基于此開(kāi)展系統(tǒng)的研究工作，目前從水稻根際中分離出一株高耐鎘氣單孢菌134，在模擬添加水稻根系常見(jiàn)分泌物后，可成功定殖于水稻根際。

根系分泌物與根際微生物相互作用的一個(gè)重要的研究方向即為兩者之間的趨化性。趨化性是一種重要的運(yùn)動(dòng)特性，允許細(xì)菌向根表面移動(dòng)，對(duì)根系分泌物的正趨化是細(xì)菌定殖的一個(gè)基本特性[4,8]。本試驗(yàn)中，除蘇氨酸與蔗糖外的其他趨化劑均能使菌株134產(chǎn)生趨化圈，其中組氨酸、亮氨酸、葡萄糖及D-果糖對(duì)氣單胞菌134具有較強(qiáng)的趨化性。Jin等[7]研究表明，韋氏桿菌 S3-1（Bacillus velezensisS3-1）對(duì)玉米根系分泌物中的葡萄糖和蘋(píng)果酸有強(qiáng)趨化作用；楊?yuàn)檴櫟萚25]研究表明，葡萄糖、組氨酸、亮氨酸和精氨酸等均能誘導(dǎo)西瓜嗜酸菌（Acidophilus）向其正趨化。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

趨化劑的濃度對(duì)細(xì)菌的正趨化作用有直接影響。Thimmaraju 等[26]研究表明，在 0～30 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，蘋(píng)果酸對(duì)枯草芽孢桿菌FB17（Bacillus subtilisFB17）的趨化作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。Yuan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌 NJN-6（Bacillus amyloliquefaciensNJN-6）對(duì)于有機(jī)酸的趨化作用隨濃度的升高而呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，其對(duì)于中等濃度（25～50 μmol/L）的有機(jī)酸的趨化作用最強(qiáng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度趨化底物對(duì)氣單胞菌134的趨化作用也各不相同，當(dāng)組氨酸、葡萄糖和果糖濃度在40～100 μmol/L時(shí)，均可誘導(dǎo)菌株134產(chǎn)生較強(qiáng)的趨化性，其CRI值都在2.00以上。尤其是當(dāng)組氨酸濃度為 40 μmol/L，葡萄糖濃度為 60 μmol/L 時(shí)，趨化作用最強(qiáng)，RCI值高達(dá)7.00以上。

為了進(jìn)一步證實(shí)這些趨化劑對(duì)于氣單胞菌134在根際定殖中的影響，本研究采取水培試驗(yàn)來(lái)考察菌株134在水稻根際的定殖情況。結(jié)果表明，滴定分析法定性試驗(yàn)中現(xiàn)象最明顯的4種趨化劑組氨酸、亮氨酸、葡萄糖及D-果糖均能促進(jìn)菌株134在水稻根際的定殖，尤其是葡萄糖和D-果糖的處理與對(duì)照組的差異極為顯著，但在實(shí)際農(nóng)田應(yīng)用中，其促進(jìn)菌株134在水稻根系定殖的情況還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

植物根際是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，其根系和根際微生物的共同作用可以改變根際環(huán)境，影響根際土壤中的各種生物有效性。采用人工施加根際有益微生物，可以改變根際生態(tài)環(huán)境的群落結(jié)構(gòu)，利于植物的生長(zhǎng)及抵抗逆境，在微生物肥料的研發(fā)上具有很大的潛力。本研究小組前面報(bào)道過(guò)，在水稻根際接種高耐鎘檸檬酸桿菌XT1-2-2（Citrobactersp.XT1-2-2）可以明顯地促進(jìn)水稻的生長(zhǎng)，提高水稻的生物量并降低稻米對(duì)鎘的吸收[27]。本研究中的氣單胞菌134分離自鎘污染水稻的根際土壤，對(duì)鎘耐受性較強(qiáng)。但關(guān)于菌株134在水稻根際定殖后對(duì)水稻的生長(zhǎng)及降鎘的影響還未開(kāi)展試驗(yàn)。接下來(lái)將重點(diǎn)研究在趨化劑的誘導(dǎo)下菌株134在土培水稻根際的定殖情況，以及定殖成功的菌株134對(duì)水稻的生長(zhǎng)及降鎘效果的影響，以期為研究菌株134與水稻根系的互作機(jī)制、目標(biāo)菌株的實(shí)際農(nóng)業(yè)應(yīng)用提供參考。