劉勝男， 王承瀟， 楊 野， 楊曉艷， 韓 偉， 崔秀明,3

（1.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，昆明 650500；2.華東理工大學藥學院，制藥工程與過程化學教育部工程研究中心，上海 200237；3.云南省三七重點實驗室，昆明 650500）

三七 （Panax notogiseng）為五加科人參屬植物[1]，主產(chǎn)于云南、廣西等省。三七總皂苷[2]（Panax notoginsengSaponins , PNS）和三七素為三七中的主要活性成分。PNS 約占三七總質(zhì)量的6%～10%，具有良好的止血功效，能明顯縮短出血和凝血時間，促進人體紅細胞分裂、生長，還具有明顯補血功效，并能顯著提高巨噬細胞吞噬率，提高血液中淋巴細胞比值，具有活血化瘀、祛瘀生新的療效，主要用于心腦血管疾病的治療。三七素[3]又稱三七氨酸、田七氨酸，是一種水溶性非蛋白氨基酸，具有較強的止血、凝血及神經(jīng)系統(tǒng)保護作用。

本文中真空冷凍干燥的干燥方式在凍結(jié)狀態(tài)下完成，因而樣品切片的物理結(jié)構(gòu)及分子結(jié)構(gòu)變化較小，組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)能被較好保存；此外真空條件使樣品隔絕空氣，更加有效地保持了原料的色澤，有效成分品質(zhì)顯著提升，樣品外觀品質(zhì)較好[4]。真空冷凍干燥機的折舊率較高，加工成本的主要影響因素為耗電量。在真空冷凍干燥過程中，真空壓強、隔板溫度等因素以及樣品性質(zhì)均會影響三七活性成分的品質(zhì)和質(zhì)量。

本文系統(tǒng)研究了三七切片厚度、干燥機真空壓強及隔板溫度對PNS 和三七素兩種化學成分的影響，并進行工藝優(yōu)化，得出最佳工藝條件，以此為三七藥材的加工提供技術(shù)指導和理論依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器

SCIENTZ-10ND 型真空冷凍干燥機，購自寧波新芝生物科技股份有限公司；Aglient 1260 型高效液相色譜儀，購自安捷倫科技有限公司；梅特勒AL-104型電子天平，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；TU-1900 型雙光束紫外可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司；3K15-高速冷凍離心機，購自德國Sigma 公司；S-4800 場發(fā)射掃描電子顯微鏡，購自日本日立公司；WFQ-510A 型傅里葉紅外變換光譜儀，購自北京北分瑞利分析儀器有限責任公司；DGG-9123AD 型電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海森信實驗儀器有限公司；SB-1100 型電熱恒溫水浴鍋，購自上海愛朗儀器有限公司；UPT-I-20T型優(yōu)普系列超純水器，購自成都超純科技有限公司。

1.2 材料

實驗所用材料選取三年生的新鮮三七，17.59～21.23 g/個（除剪口），購于云南文山，經(jīng)昆明理工大學楊野教授鑒定為五加科植物三七的干燥根莖。

1.3 試劑

三七皂苷R1對照品(批號:138902)，人參皂苷Rg1對照品(批號:140509)，人參皂苷Rb1對照品(批號:140651)，人參皂苷Rd 對照品(批號:140302)，人參皂苷Re 對照品(批號:140285)，三七素對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.4 樣品處理方法

1.4.1 工藝流程 樣品處理工藝流程為：取適量新鮮三七清洗其表面雜質(zhì)→切片→稱重→均勻平鋪于物料盤上→進行真空冷凍干燥。

1.4.2 真空冷凍干燥工藝的單因素試驗 選取切片厚度（3、5、7、9 mm）、隔板溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、真空壓強（30、40、50、60、70、80 Pa）3 個因素，在不同干燥時間內(nèi)測定PNS 及三七素的質(zhì)量分數(shù)變化。

1.4.3 真空冷凍干燥工藝響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，采用響應面優(yōu)化方法對三七冷凍干燥工藝進行優(yōu)化。根據(jù)中心組合設計(CCD)的方法，以隔板溫度(A)和真空壓強(B)為影響因子，PNS 質(zhì)量分數(shù)(T1)、三七素質(zhì)量分數(shù)(T2)為響應值，設計兩因素三水平的響應面試驗，CCD 因素與水平如表1 所示。

表1 中心組合設計因素與水平Table 1 Central composite design factor and level

1.4.4 滿意度函數(shù) 采用滿意度函數(shù)[5]同時考察PNS 及三七素的質(zhì)量分數(shù)。每一個考察指標（響應值）均按下列方程式轉(zhuǎn)化為量綱為一的期望值，滿意度函數(shù)的平衡尺度（d）范圍為0～1，d=0 說明響應值

表2 凍干三七的考察指標和最低期望響應值、最高期望響應值及權(quán)重值Table 2 Investigation index, minimum expected response value,maximum expected response value and weighted value of freeze-drying panax notoginseng

1.5 指標測定

回歸方程表明PNS 在100～1 000 μg/mL下線性關(guān)系良好。精密度相對標準偏差（RSD）值分別為4.30%、2.97%、3.62%、4.18%、1.96%；重復性RSD 值分別為2.73%、1.96%、1.87%、2.24%、2.28%。結(jié)果表明該方法的精密度、重復性及穩(wěn)定性良好。

1.5.2 三七素質(zhì)量分數(shù)測定 采用高效液相法測定

三七中三七素質(zhì)量分數(shù)[7]，參考課題組前期工作[8]，色譜條件：分析柱 Welchrom C18(4.6 mm × 250 mm × 5 μm)，以水-甲醇(體積比為95∶5)作為流動相，流速為0.5 mL/min，樣品進樣體積20 μL，測得三七素的回歸方程：

方程表明三七素在50～500 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好，并測得精密度RSD 值為0.78% (n=6)；重復性RSD 值為3.58%(n=5)，穩(wěn)定性RSD 值為0.94%。結(jié)果表明該方法的精密度、重復性及穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同切片厚度對三七活性成分的影響

真空冷凍干燥過程中，PNS、三七素質(zhì)量分數(shù)隨切片厚度（真空壓強及隔板溫度一定）變化的規(guī)律見表3。由表可知，PNS 和三七素質(zhì)量分數(shù)隨著切片厚度的增加呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，兩者均在切片厚度為5 mm 時，質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)最大值，分別為9.084% ±0.487%、1.872%±0.001%。因此，首先固定切片厚度為5 mm，再進行后續(xù)的干燥條件考察。

表3 切片厚度對三七主要成分的影響Table 3 Influence of slice thickness on the main constituent ofPanax notoginseng

2.2 不同干燥條件對三七主要成分的影響

2.2.1 隔板溫度對三七活性成分的影響 圖1 示出了固定切片厚度為5 mm、真空壓強為55 Pa 時，在不同隔板溫度下三七中有效成分的變化規(guī)律。由圖可知，PNS 質(zhì)量分數(shù)隨著溫度升高呈先升高后下降的趨勢，當溫度達到45 ℃時，PNS 質(zhì)量分數(shù)出現(xiàn)最大值，為8.532%。由圖1（b）可知，三七素質(zhì)量分數(shù)隨隔板溫度升高同樣呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當隔板溫度為40 ℃時，三七素質(zhì)量分數(shù)出現(xiàn)最高值，為1.872%。

2.2.2 真空壓強對三七活性成分的影響 圖2 示出了當固定切片厚度為5 mm、隔板溫度為45 ℃時，在不同真空壓強下三七中有效成分的變化規(guī)律。由圖可知，真空壓強為30～60 Pa 時，隨著壓強的增大，PNS 質(zhì)量分數(shù)也呈逐漸上升的趨勢；當壓強為60 Pa時，PNS 質(zhì)量分數(shù)出現(xiàn)最大值，為9.743%；當壓強為50 Pa 時，三七素質(zhì)量分數(shù)出現(xiàn)最大值，為1.815%。綜合可得，當壓強在50 ～60 Pa 范圍內(nèi)，三七活性成分相對較高，因此選擇該區(qū)間進行響應面優(yōu)化試驗。

由上述單因素考察結(jié)果可知，干燥工藝各參數(shù)對三七中兩種成分的質(zhì)量分數(shù)均有較大影響，且各指標隨考察因素（真空壓強、隔板溫度）的變化規(guī)律也不盡相同。因此不能以單一考察指標代表三七整體品質(zhì)，可采用響應面優(yōu)化的方法綜合、系統(tǒng)地反映干燥工藝對三七整體品質(zhì)因素的影響。

2.3 不同水平下三七活性成分變化曲線

分別將溫度和真空壓強水平（Level）取值?1.0、0、1.0，代入方程（1）和（2），繪制兩個因素對PNS 和三七素兩個指標的交互作用曲線，如圖3、圖4 所示。由圖3(a)可知，溫度-PNS 曲線在溫度考察范圍內(nèi)呈現(xiàn)較大的上升趨勢。不同的真空壓強水平下，溫度-PNS 曲線的形狀特征改變較小。另一方面，由圖3(b)可知，隨著隔板溫度水平的上升，壓強-PNS 曲線逐漸上移，且總體形狀保持不變。由此可知，對于PNS 而言，隔板溫度是干燥過程中影響其質(zhì)量分數(shù)變化的主要因素。

圖1 三七活性成分隨隔板溫度的變化曲線Fig.1 Curve of the active constituent of Panax notoginseng varying with the clapboard temperature

由圖4(a)可知，當真空壓強水平為?1.0 時，三七素質(zhì)量分數(shù)隨著隔板溫度水平的升高逐漸下降；當真空壓強水平為0 和1.0 時，三七素-隔板溫度曲線形狀發(fā)生了改變，呈現(xiàn)先升后降的趨勢。值得注意的是，在隔板溫度水平較低的時候，真空壓強水平對三七素質(zhì)量分數(shù)影響不大；而當隔板溫度水平較高的時候，真空壓強水平的變化將顯著影響三七素的質(zhì)量分數(shù)，表明此時真空壓強和隔板溫度之間存在顯著的相互作用。由圖4(b)可知，在隔板溫度水平為?1.0 和0 的時候，真空壓強-三七素曲線較為平緩，表明此時三七素質(zhì)量分數(shù)主要是受溫度的影響。而當溫度隔板水平為1.0 的時候，真空壓強-三七素曲線呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，表明在該溫度水平下三七素質(zhì)量分數(shù)受真空壓強的影響較大。而3 條曲線呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，表明了溫度和壓強之間顯著的交互作用。

2.4 CCD 試驗結(jié)果分析及滿意度分析

CCD 試驗結(jié)果見表4，利用Design Expert 11 對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，建立以PNS 質(zhì)量分數(shù)(T1)、三七素質(zhì)量分數(shù)(T2)和總體滿意度D為目標函數(shù)的二次回歸方程，并對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗（表5～7）。

根據(jù)CCD 試驗設計結(jié)果進行滿意度分析。取表2中的y1l=6.5，y1h= 10.1，y2l=1.0，y2h=1.9。

圖2 三七活性成分隨真空壓強的變化曲線Fig.2 Curve of active constituent of Panax notoginseng varying with vacuum pressure

圖3 不同水平條件對PNS 質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.3 Effect of different level conditions on the mass content of PNS

圖4 不同水平條件對三七素質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.4 Effects of different level conditions on the mass content of Dencichine

表4 CCD 試驗設計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of CCD design

由表6 方差分析所示，該回歸模型極顯著（P＜0.01），說明三七素質(zhì)量分數(shù)與各變量之間存在顯著的線性相關(guān)，可以利用模型預測響應值三七素質(zhì)量分數(shù)與變量之間的關(guān)系。其中一次項A-PRE 隔板溫度不顯著，說明A-PRE對三七素質(zhì)量分數(shù)沒有顯著影響；B-TEM 隔板溫度顯著，交叉項AB顯著，說明隔板溫度和真空壓強對三七素質(zhì)量分數(shù)有顯著交叉影響。二次項A2、B2顯著。

由表5、表6 可知，模型極顯著(P＜0.01)，失擬值不顯著(P＞0.05)，說明該回歸方程的擬合效果好，試驗設計方案具有可操作性。A、B兩個因素對響應值T1的影響效果大小順序為：A＞B、對響應值T2的影響效果大小順序為：B＞A。

表5 T1 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of T1 regression model

表6 T2 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of T2 regression model

表7 以總滿意度D 為響應值的回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression with overall desirability D as response value

2.4.3 以總體滿意度D為響應值的方差及響應面分析 為保證PNS 和三七素在干燥過程中最大程度保留，采用響應面和等高線對總體滿意度D進行分析[10]?？傮w滿意度D與真空壓強(A)和隔板溫度(B)的響應面分析結(jié)果見圖5 所示。

交互效應的強弱可根據(jù)等高線的形狀體現(xiàn)，圓形表示兩因素交互作用較強。由圖5(a)、5(b)可看出，壓強和溫度對總滿意度的影響存在交互作用，且隨著真空壓強、隔板溫度水平的增加，總體滿意度D呈先增大后減小的趨勢。

總體滿意度D與真空壓強（A）和隔板溫度（B）的二次多項回歸方程如下：

由表7 方差分析所示，該回歸模型極顯著（P＜0.01），可預測響應值總體滿意度與變量之間的關(guān)系。將多響應值轉(zhuǎn)化為單響應值即總體滿意度D，根據(jù)軟件Design Expert 11 的分析結(jié)果，利用響應面法求解D，得到理論最大總體滿意度為4.353，代入式（12）～（14）中，求得此時對應的壓強為56.9 Pa，溫度為45.2 ℃，相應的PNS 質(zhì)量分數(shù)9.77%，三七素質(zhì)量分數(shù)1.76%。由表4 所示，以PNS 質(zhì)量分數(shù)最大的響應值10.066%，所對應的三七素質(zhì)量分數(shù)1.026%進行滿意度計算，此時滿意度為0.145；以三七素質(zhì)量分數(shù)最大的響應值1.777%，所對應的PNS 質(zhì)量分數(shù)9.506%進行滿意度計算，此時滿意度為4.141，均低于最大總體滿意度4.353。表明滿意度函數(shù)法能在多響應值之間取得均衡，適用于多響應值優(yōu)化。

圖5 總體滿意度D 響應面圖Fig.5 Response surface graph of overall desirability D

在最優(yōu)條件下平行重復3 次試驗，得出PNS 和三七素質(zhì)量分數(shù)對應的總體滿意度D值分別為4.315、4.264 和4.249 (平均值4.276)，與預測D值較為接近，證明該優(yōu)化方法穩(wěn)定可信。

2.5 SEM 表征

在優(yōu)化工藝下制備冷凍干燥三七樣品，并采用掃描電子顯微鏡(SEM)對不同干燥方式的三七及鮮三七(Fresh Samples, FS)的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。結(jié)果如圖6 所示。由圖可知，F(xiàn)S 的SEM 圖可見清晰的組織結(jié)構(gòu)和排列有序的細胞。自然干燥(Room Temperature Drying, RTD)樣品出現(xiàn)了一定程度的自然氧化導致的顏色加深。熱風干燥(Hot Air Drying, HD)樣品三七切片內(nèi)部出現(xiàn)了嚴重組織收縮變形和細胞塌陷，宏觀表現(xiàn)為較嚴重的氧化變色以及皺縮變形，樣品硬度最大。而真空冷凍干燥(Freeze-drying in Vaccum,FD)樣品由于在相對溫和的干燥條件下操作，樣品內(nèi)部細胞或組織結(jié)構(gòu)沒有或發(fā)生了最小程度的熱損傷，且未觀察到較大程度的組織收縮和細胞塌陷，所以內(nèi)部細胞或組織結(jié)構(gòu)得以完好保存。

2.6 物料色度分析

比較不同干燥方式的樣品與新鮮樣品的色度值，樣品色度分析結(jié)果通過色度儀直接測出，見表8。

圖6 不同干燥方式下的三七樣品SEM 圖(100 kPa)Fig.6 SEM diagrams of Panax notoginseng samples dried in different ways (100 kPa)

由表8 可知，在不同干燥樣品的色度測定結(jié)果中，HD、RTD 及FD 樣品的亮度均顯著高于FS 樣品（P＜0.05），且三者之間亮度大小順序為FD＞RTD＞HD，這與樣品在干燥過程中被氧化而發(fā)生褐變的程度呈正相關(guān)。紅綠值的大小順序為FD＞HD＞FS＞RTD，黃藍值的大小順序為HD＜FD＜RTD＜FS。干燥后的FD樣品與FS 樣品的總色差差異極顯著（P＜0.01），色度、紅綠值和黃藍值都遠大于FS 樣品，這是由于三七切片的干燥在凍結(jié)狀態(tài)下完成，其物理結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)變化極小，組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)被較好地保存，說明采用真空冷凍干燥的三七切片樣品的感官品質(zhì)最佳。

表8 不同干燥方式下的樣品色度分析Table 8 Chromaticity analysis samples under different drying methods

3 結(jié)束語

PNS 與三七素均為三七的次級代謝產(chǎn)物，主要分布在胞漿及細胞質(zhì)等液體環(huán)境中，隨著干燥環(huán)境的變化，細胞中液體質(zhì)量分數(shù)和PNS 成分逐漸減少，導致PNS 活性成分降低；而三七素是一種水溶性非蛋白氨基酸[11]，在相對溫度較高的條件下，氨基酸成分易受到破壞。真空冷凍干燥過程是在低溫且基本隔絕空氣的條件下進行，能夠有效地保護三七活性成分、保持三七的色澤、藥性和藥味，同時可避免細胞的機械破壞，減少細胞內(nèi)成分的損失[12]。本文研究結(jié)果表明，在真空干燥過程中，隔板溫度和真空壓強是影響PNS 和三七素質(zhì)量分數(shù)的主要因素。通過Design Expert11 軟件并結(jié)合滿意度函數(shù)對真空冷凍干燥工藝進行綜合分析，得出最佳工藝為隔板溫度45.2 ℃、真空壓強56.9 Pa。經(jīng)過試驗驗證，該條件下PNS 及三七素平均質(zhì)量分數(shù)分別達到9.77%、1.76%，與預測值相符，優(yōu)化效果明顯。該研究能夠為三七藥材的真空冷凍干燥工藝提供理論參考，同時對三七新型飲片的開發(fā)具有一定的指導意義。