鄧希樂，鄭文娜，柏連陽

（雜草生物學及安全防控湖南省重點實驗室，湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南省農(nóng)業(yè)科學院，長沙 410125）

除草劑從發(fā)現(xiàn)到推廣應(yīng)用至今，為全世界的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出了重大貢獻，但除草劑通常對作物和雜草的選擇性比較差，容易對敏感作物，如水稻、玉米、高粱等產(chǎn)生藥害，限制了它在田間的進一步應(yīng)用[1-3]。目前解決除草劑藥害問題主要有3種方法：①開發(fā)具有選擇性的除草劑[4]；②培育具有除草劑抗性的作物植株[5]；③在除草劑中加入能提高其選擇性的安全劑[6]。前兩者投入大，不確定性因素多，對相應(yīng)的技術(shù)要求較高。因此，使用除草劑安全劑（herbicide safener）是解決除草劑藥害問題最為直接、有效的方法[7-8]。除草劑安全劑又被稱為解毒劑（antidote）、保護劑（protectant），是一類在不影響除草劑對靶標雜草除草活性的前提下，有選擇地保護作物抵抗除草劑的藥害，進而增強作物的安全性、提高除草劑的安全性、改進雜草防治效果的化合物[9]。自20世紀60年代，第一個商品化試劑1,8-萘二甲酸酐（1,8-naphthalic anhydride, NA）被報道以來，目前已經(jīng)有20多種商品化的除草劑安全劑，例如二氯丙烯酰胺、解草啶、解草酮、呋喃解草唑、解草胺等，被開發(fā)與應(yīng)用[10-11]。

在商品化除草劑安全劑的幾十年的使用過程中，部分安全劑被發(fā)現(xiàn)對環(huán)境存在潛在威脅。水生物種（水藻和魚類）對解草酮與呋喃解草唑特別敏感，其中解草酮對水藻具有高毒性（LC50值為0.63 mg/L）。解草酮對魚類具有中等毒性，如對斑點叉尾鮰的LC50值為1.4 mg/L；低濃度（0.016 mg/L）的解草酮長期曝露于水體中能夠?qū)е潞琪V魚體重的顯著下降。另外，解草酮還對陸生無脊椎動物（跳蟲）及維管植物（浮萍）具有中等毒性[12]。因此，亟需研發(fā)出高效、低毒、且對環(huán)境相對友好的除草劑安全劑品種。

天然產(chǎn)物是天然源農(nóng)藥和農(nóng)藥先導化合物的重要來源[13-14]。本課題組在前期，從中草藥植物資源中已篩選出一些具有除草劑安全劑活性的混合物或者單體化合物，如山椒素（sanshool）、呋喃香豆素（furocoumarin）、Z-藁本內(nèi)酯（Z-ligustilide）、洋川芎內(nèi)酯A（ligusticide A）及紫錐菊烷基酰胺（echinacea alkylamide）等[15-18]，但均存在活性不突出，提取成本高，結(jié)構(gòu)較復雜，不易合成等缺點。所以，仍有待從天然產(chǎn)物中新挖掘出的結(jié)構(gòu)簡單、易于獲得且具有良好除草劑安全劑活性的物質(zhì)。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）廣泛存在于各種植物體內(nèi)，是一類植物激素和信號分子（圖1）。適量的施用茉莉酸甲酯可誘導果蔬體內(nèi)抗蟲相關(guān)物質(zhì)（可溶性糖、葉綠素、酚類化合物等）含量的提高以增強果蔬的抗蟲性[19-20]。茉莉酸甲酯外施于果蔬還能夠增強果蔬的抗病能力和抗冷能力，改善果蔬采摘后的耐貯性及感官品質(zhì)[21]。例如，外施茉莉酸甲酯能夠有效地減輕干旱脅迫對甜菜幼苗造成的危害[22]；適量濃度的茉莉酸甲酯能夠誘導葡萄果肉細胞中有益物質(zhì)二苯乙烯類化合物的積累，從而增加葡萄的耐貯性[23]，而使用適宜濃度的茉莉酸甲酯處理葡萄，能夠增加葡萄的產(chǎn)量以及提高葡萄果肉的品質(zhì)[24]；用適當劑量的茉莉酸甲酯處理水稻后，水稻每穗總粒數(shù)和產(chǎn)量均有所增加[25]。此外，盡管關(guān)于茉莉酸甲酯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用有很多報道，但目前關(guān)于茉莉酸甲酯具有除草劑安全劑活性的報道卻十分鮮見。

圖1 茉莉酸甲酯結(jié)構(gòu)式

因此，本研究采用瓊脂培養(yǎng)基法測試了茉莉酸甲酯緩解兩種氯乙酰胺類除草劑（精異丙甲草胺及乙草胺）和一種芳基吡啶甲酸酯類除草劑（氯氟吡啶酯）對水稻藥害的安全劑活性，旨在從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)簡單，易于改造，且具有較好的安全劑活性的先導化合物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茉莉酸甲酯（純度98%），長春三邦醫(yī)藥科技有限公司；精異丙甲草胺制劑（S-metolachlor，960 g/L），浙江農(nóng)資集團金泰貿(mào)易有限公司；乙草胺（acetochlor，960 g/L），遼寧省營口三征農(nóng)用化工有限公司；氯氟吡啶酯（halauxifen-methyl，3%乳油），陶氏益農(nóng)公司；丙酮，中國上海國藥集團有限公司。所用的溶劑在進一步純化和干燥后使用。水稻種子（湘早秈45號），袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司；瓊脂培養(yǎng)基，西安大豐收生物科技有限公司。

2.2 試驗方法

水稻萌發(fā)的方法參考Deng等[26]和Zheng等[27]報道的方法。挑選籽粒飽滿、大小均勻、無病蟲鼠害的水稻種子（湘早秈45號）用0.1%的次氯酸消毒15 min后，再用去離子水沖洗3遍，然后用去離子水將種子在28℃下浸泡24 h，接著在28℃下的黑暗條件下催芽36 h。

0.3%的瓊脂培養(yǎng)基中除草劑（精異丙甲草胺、乙草胺及氯氟吡啶酯）工作濃度的配置：量取3L去離子水，然后加熱，待去離子水快沸騰時加入12 g瓊脂條，一邊加熱一邊攪拌，使得瓊脂溶解充分。然后將熱瓊脂液倒入5 L燒杯中，用去離子水定容至4 L，0.3%瓊脂培養(yǎng)基配置完成。期間，取濃度為960 g/L精異丙甲草胺，加入去離子水稀釋1 000倍，充分混勻，即得960 mg/L精異丙甲草胺工作液。待液體瓊脂培養(yǎng)基溫度降到45℃左右時，量取3個200 mL液體瓊脂培養(yǎng)基分別裝到250 mL的塑料盒，作為空白對照組；另外，用2 L燒杯量取1.2 L瓊脂培養(yǎng)基液體，并往該培養(yǎng)基中加入84 μL精異丙甲草胺工作液，即配置成0.073 mg/L精異丙甲草胺瓊脂糖培養(yǎng)基。充分混勻后，及時分裝到3個250 mL的塑料盒中，每個盒子加200 mL培養(yǎng)基。乙草胺、氯氟吡啶工作濃度配置方法類似（濃度同樣為0.073 mg/L）。

茉莉酸甲酯對瓊脂培養(yǎng)水稻幼苗的解毒效果測定：以測試茉莉酸甲酯對精異丙甲草胺的解毒效果為例。待瓊脂培養(yǎng)基液體在50℃左右時，首先把空白組3個重復配制好，剩余瓊脂培養(yǎng)基液體直接配制成的0.073 mg/L精異丙甲草胺培養(yǎng)基，分裝除草劑處理組3個重復后，再配制除草劑與等比濃度梯度的茉莉酸甲酯混合培養(yǎng)基。

等比濃度梯度茉莉酸甲酯的配制：先稱取適量的茉莉酸甲酯，用適量丙酮充分溶解后，加適量吐溫，使其充分乳化。首先配制終濃度為0.50 mg/L的茉莉酸甲酯工作液，分裝最高濃度處理組后，將剩余的一半逐級稀釋配制其他濃度處理組，最后茉莉酸甲酯在瓊脂中對水稻幼苗的處理濃度從高到低分別為0.50 mg/L、0.25 mg/L、0.20 mg/L、0.15 mg/L、0.10 mg/L和0.05 mg/L。采用同樣的方法測試茉莉酸甲酯對乙草胺和氯氟吡啶酯的解毒效果。

選取胚根萌發(fā)一致的水稻幼苗（一葉期）移栽到含有不同濃度（0.05～0.50 mg/L）茉莉酸甲酯的瓊脂培養(yǎng)基的塑料圓形透明的小盒子中（規(guī)格：口內(nèi)徑6 cm，容積250 mL），然后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。首先光照14 h（光照強度110～130 μE m-2s-1，溫度為30℃），接著在黑暗條件下（溫度為25℃）培育10 h。7天后測量數(shù)據(jù)，通過株高、根長和鮮重3個指標，測定茉莉酸甲酯作為安全劑的活性。所有試驗均重復測試次3次。株高、根長和鮮重3個指標計算公式如下：

2.3 數(shù)據(jù)分析

所有安全劑活性的實驗均重復3次。利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。新復極差法（Duncans）比較不同處理的差異性顯著。不同小寫字母表示在該差異水平上具顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對精異丙甲草胺處理水稻幼苗株高鮮重的影響

采用瓊脂法測試了不同濃度下的茉莉酸甲酯對3種除草劑（精異丙甲草胺、乙草胺及氯氟吡啶酯）的安全劑效果。如表1所示，單獨使用精異丙甲草胺（0.073 mg/L），不使用茉莉酸甲酯時，水稻幼苗的株高相對值、根長相對值及鮮重相對值分別為44.86%，47.35%及61.24%，表明該濃度下精異丙甲草胺對水稻幼苗的生長發(fā)育具有抑制作用。使用濃度為0.05～0.50 mg/L的茉莉酸甲酯作為安全劑時，能夠有效地緩解精異丙甲草胺對水稻幼苗造成的損傷。其中茉莉酸甲酯使用濃度為0.25 mg/L，對水稻株高和根長的保護效果最好（分別為70.10%、82.49%和89.47%）。值得注意的是，隨著使用濃度的逐漸提高，茉莉酸甲酯對水稻幼苗的保護呈現(xiàn)出先緩慢升高再降低的趨勢。

表1 處理7 d 后不同濃度下茉莉酸甲酯對精異丙甲草胺處理水稻幼苗株高、根長及鮮重的影響

2.2 茉莉酸甲酯對乙草胺處理水稻幼苗株高、根長及鮮重的影響

表2測試結(jié)果表明，單獨使用乙草胺，水稻幼苗的相對株高，根長和鮮重分別為44.6%、45.36%及67.09%，與精異丙甲草胺具有類似的結(jié)果，同樣表明了該濃度下乙草胺對水稻幼苗的生長發(fā)育具有抑制作用。使用濃度為0.05～0.50 mg/L時，茉莉酸甲酯作為安全劑同樣能夠有效地保護水稻幼苗免受來自乙草胺造成的藥害。當茉莉酸甲酯使用濃度為0.25 mg/L，對水稻幼苗株高和鮮重的保護效果最好（分別為69.27%和87.22%）；使用濃度為0.10 mg/L，對水稻幼苗根長的保護效果最好（65.68%）。隨著使用濃度的逐漸提高，茉莉酸甲酯對水稻幼苗的株高的保護效果表現(xiàn)出先緩慢升高再降低的趨勢，但對根長和鮮重的保護效果則沒有明顯的規(guī)律。

表2 處理7 d 后不同濃度下茉莉酸甲酯對乙草胺處理水稻幼苗株高、根長及鮮重的影響

2.3 茉莉酸甲酯對氯氟吡啶酯處理水稻幼苗株高、根長及鮮重的影響

表3也表明了與酰胺類除草劑類似的結(jié)果，單獨使用氯氟吡啶酯，對水稻幼苗的株高，根長和鮮重的具有一定的影響，株高、根長和鮮重的相對值分別為46.13%、47.34%及69.17%，使用濃度為0.05～0.50 mg/L時，茉莉酸甲酯能有效地緩解氯氟吡啶酯對水稻幼苗藥害。當茉莉酸甲酯使用濃度為0.20 mg/L，對水稻幼苗株高的保護效果最好（68.23%）；使用濃度為0.25 mg/L，對水稻幼苗的根長和鮮重保護效果最好（73.14%和80.16%）。隨著使用濃度的逐漸提高，茉莉酸甲酯對水稻幼苗的株高、根長和鮮重的保護效果也是呈現(xiàn)出先緩慢升高再降低的趨勢。

表3 處理7 d 后不同濃度下茉莉酸甲酯對氯氟吡啶酯處理水稻幼苗株高、根長及鮮重的影響

3 結(jié)論與討論

雖然茉莉酸甲酯具有各種藥理學特性，但關(guān)于茉莉酸甲酯具有安全劑活性的報導尚屬第1次。本文采用瓊脂培養(yǎng)基法測試了茉莉酸甲酯緩解2種氯乙酰胺類除草劑（精異丙甲草胺及乙草胺）和1種芳基吡啶甲酸酯類除草劑（氯氟吡啶酯）對水稻藥害的安全劑活性。結(jié)果表明，在這3種除草劑的使用濃度為0.073 mg/L時，茉莉酸甲酯均能有效地保護水稻抵抗來自3種除草劑的損傷。由此可見，茉莉酸甲酯不僅對酰胺類除草劑（精異丙甲草胺和乙草胺）造成的損傷具有較好的緩解效果，而且對芳基吡啶甲酸酯類除草劑（氯氟吡啶酯）也同樣具有較好的保護效果，茉莉酸甲酯可能具有緩解多種不同類型除草劑對水稻藥害的潛力。茉莉酸甲酯作為天然激素廣泛存在于植物體內(nèi)，作為安全劑對環(huán)境相對比較安全，因此可以作為先導化合物用于環(huán)境友好的新型除草劑安全劑的研發(fā)。但茉莉酸甲酯與商品化藥劑相比具有用量大，活性不夠突出的缺陷，有待進行進一步的結(jié)構(gòu)改造。此外，茉莉酸甲酯作為安全劑的作用機理尚不明確；茉莉酸甲酯作為具有手性的農(nóng)藥小分子，其異構(gòu)體的安全劑效果也值得進一步研究。