金曉懷,林志鑾,張傳海,馬春華,任宇紅,武廣珩

(1.武夷學(xué)院 玉山健康管理學(xué)院,福建 南平 354300；2.武夷學(xué)院 分析測試中心,福建 南平 354300；3.武夷學(xué)院 福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 南平 354300；4.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院 武夷山 354300；5.華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院,上海 200237)

武夷巖茶是十大名茶之一,在獨(dú)特的武夷山自然環(huán)境條件下選用適宜的茶樹品種進(jìn)行繁育和栽培,并用獨(dú)特的傳統(tǒng)加工工藝制作而成、具有巖韻(“巖骨花香”)品質(zhì)特征的烏龍茶.目前,針對(duì)不同產(chǎn)地武夷巖茶茶葉中咖啡因的含量鮮有報(bào)道,不同的產(chǎn)地茶葉茶葉中咖啡因、香氣成分含量也不一樣,茶葉的品質(zhì)也不一樣,價(jià)格也不一樣.

咖啡因(Caffeine,1,3,7-三甲基黃嘌呤) 是一種嘌呤類生物堿,存在于日常生活中的茶葉、咖啡、可可飲料、巧克力以及一些軟飲料中[1].茶葉中咖啡因的含量占干物質(zhì)的2%～5%,是茶葉重要的品質(zhì)和功能成分,是決定茶葉顏色的主體成分,也是茶飲料品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[2].其測定方法主要有氣泡微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法[3]、比色法[4]、高效液相色譜法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]、離子色譜法[8]、TLC法[9]、液相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法[10]、紅外光譜法[11]等.

據(jù)報(bào)道,陳德華[12]認(rèn)為茶葉品質(zhì)一般情況下主要由以下幾個(gè)因素有關(guān)系：茶樹品種、自然環(huán)境、樹齡、加工技術(shù)、制茶時(shí)天氣.武夷巖茶的風(fēng)味和價(jià)格與產(chǎn)地、加工工藝可能有明顯的變化[13].且越是核心產(chǎn)區(qū)其價(jià)格高,茶葉品質(zhì)也越好.由此,開展武夷巖茶茶葉不同產(chǎn)地中咖啡因的含量具有十分重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義.本研究擬通過對(duì)武夷巖茶茶葉中咖啡因化合物提取方式和色譜分離條件的探討,同時(shí)研究了不同產(chǎn)地、不同加工過程中茶葉的咖啡因含量的差異,為區(qū)別不同產(chǎn)地、加工過程對(duì)武夷巖茶品質(zhì)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣采集于福建省武夷山市武夷香江茗苑茶文化觀光園加工過程中取樣,2017年新生幼芽(2葉1芽)茶葉樣本,包括：肉桂、水仙、奇丹3個(gè)品種；從武夷山景區(qū)的不同產(chǎn)地中抽取樣品,共計(jì)8種樣品,每種樣品分別在鮮葉、萎凋、搖青、殺青、捻揉、毛茶等加工過程中進(jìn)行取樣,合計(jì)8個(gè)樣品.液氮保存后,帶回實(shí)驗(yàn)室后,放超低溫冰箱中(-80 ℃)保存.供試樣本信息詳見表1.

表1 試驗(yàn)樣品編號(hào)及名稱

咖啡因?qū)φ掌焚徸再惸w世爾科技有限公司,純度均大于98%；乙腈為色譜純(美國新天地公司生產(chǎn)),水為超純水；無水乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、無水Na2SO4、硅膠均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,提取用的有機(jī)溶劑均重新蒸餾,大孔樹脂(陜西博暉生化科技有限公司)、其他試劑均為分析純.無水Na2SO4,大孔樹脂,硅膠使用前在120 ℃下烘干2 h.

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器：Agilent1260型高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC) (UV 檢測器：G1314F,1260VWD、二元高壓恒泵：G1312C,1260Bin Pump VL)； Agilent TC C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) ； S10H超聲波清洗機(jī)[致微(廈門)儀器有限公司].BT25S型天平賽多利斯科技有限公司(d=0.01mg).

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相：A為乙腈,B為哇哈哈純凈水,梯度洗脫,洗脫程序見表2；流速：1.000 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：274 nm,進(jìn)樣量：10 μL.

表2 梯度洗脫程序

1.3.2 工作曲線的測定

準(zhǔn)確稱取咖啡因?qū)φ掌?.00 mg,于10 mL 容量瓶中,用甲醇定容,搖勻,制得母液,分別稀釋至1、5、10、15、20、25、30 μg/mL,過0.45 μm微孔濾膜,在1.3.1色譜條件下進(jìn)行分離測定后,測定其峰面積.以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X、峰面積為縱坐標(biāo)作圖Y,并進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程.

1.3.3 茶葉中咖啡因含量的測定

準(zhǔn)確稱取茶葉1.000 g,加入10 mL提取液,按照確定的優(yōu)化條件,進(jìn)行超聲提取,取上層清液2.00 mL,加0.10 g無水Na2SO4+0.10 g大孔樹脂振蕩除去水分,靜置3～5 min后,取上層清液 1.00 mL,過0.45 μm濾膜,備用.然后根據(jù)1.3.2的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程,得到各樣品測試液的咖啡因質(zhì)量濃度(mg/mL)；再按下式(1)計(jì)算不同樣品的多糖含量.

(1)

式中ρ為稀釋后樣品溶液多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)；N為稀釋倍數(shù)；V為最初定容體積(mL)；M為樣品質(zhì)量(g).

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以咖啡因含量為指標(biāo),分別對(duì)超時(shí)功率(540、630、720、810、900 W),超聲時(shí)間(10、15、20、25、30 min),提取液種類(重蒸甲醇、重蒸無水乙醇、重蒸乙酸乙酯、重蒸二氯甲烷、重蒸丙酮)10 mL、凈化劑種類(0.10 g無水Na2SO4+0.10 g硅膠,0.10 g無水Na2SO4+0.10 g大孔樹脂,0.10 g無水Na2SO4)等有關(guān)因素進(jìn)行考察和分析,按照1.3.1進(jìn)行測定,1.3.3進(jìn)行提取.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.5 樣品加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)

按照1.3.1和1.3.3進(jìn)行提取與測定.分別對(duì)茶葉中咖啡因進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)：取茶葉供試液做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),每個(gè)平行測6次,計(jì)算樣品加標(biāo)回收率；穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批武夷巖茶供試品溶液,分別于 0、4、8、12、16、20、24 h 后,進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)；精密度試驗(yàn)：取同一批武夷巖茶供試品溶液進(jìn)行精密度試驗(yàn),連續(xù)進(jìn)樣5次.重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批茶葉5份進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn).

1.4 不同產(chǎn)地與加工工藝茶葉啊咖啡因含量變化

按照1.3.1和1.3.3實(shí)驗(yàn)步驟,對(duì)不同產(chǎn)地、不同加工過程中茶葉中咖啡因含量的提取與測定,代入公式(1)中,計(jì)算每個(gè)茶葉中咖啡因含量,做出不同產(chǎn)地、加工過程中茶葉中咖啡因含量的變化圖形.

1.5 聚類分析

運(yùn)用SPSS的PASWStatistics18軟件數(shù)據(jù)處理,軟件處理：采用系統(tǒng)聚類分析方法.以咖啡因含量為變量,聚類方法采用組間鏈接法,度量標(biāo)準(zhǔn)采用平方Eudidean距離,對(duì)8個(gè)武夷巖茶茶葉樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(可變類平均法)分析,得到武夷巖茶茶葉聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡因工作曲線建立

按照1.3.1色譜條件分別對(duì)茶葉樣品和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行洗脫.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,按上述洗脫條件,茶葉中咖啡因得到很好的分離.咖啡因出峰時(shí)間為14.51 min.如圖1所示.采用外標(biāo)法進(jìn)行分析,咖啡因的線性范圍：1、5、10、15、20、25、30 μg/mL,線性方程：Y= 684.27X+4.813 7,相關(guān)系數(shù)：R2=0.999 9,如圖2所示.

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同溶劑對(duì)咖啡因含量的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品(精確至 0.000 1 g),分別討論了不同提取溶劑對(duì)茶葉中咖啡因含量進(jìn)行提取.加重蒸甲醇、重蒸無水乙醇、重蒸乙酸乙酯、重蒸二氯甲烷、重蒸丙酮10 mL,按實(shí)驗(yàn)步驟1.3.3進(jìn)行提取,測定條件按照1.3.1進(jìn)行測定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇做為溶劑提取茶葉樣品的咖啡因含量最高,達(dá)到了18.90 mg/g,不同溶劑提取咖啡因的效果有明顯差別.其順序?yàn)椋杭状?乙酸乙酯>乙醇>丙酮>二氯甲烷,其中,二氯甲烷做為溶劑最低提取茶葉樣品的咖啡因含量最低,僅有0.35 mg/g,所以本次試驗(yàn)采用甲醇作為提取溶劑.如圖3所示.

2.2.2 不同凈化劑對(duì)咖啡因含量優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品(精確至 0.000 1 g),分別采用無水Na2SO4和硅膠、無水Na2SO4和大孔樹脂、無水Na2SO43種凈化劑對(duì)咖啡因提取的影響,按實(shí)驗(yàn)步驟1.3.3進(jìn)行提取,測定條件按照1.3.1進(jìn)行測定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用無水硫酸鈉和大孔吸附樹脂凈化劑時(shí),咖啡因含量達(dá)到最大,含量為19.47 mg/g.無水硫酸鈉和硅膠作為凈化劑時(shí)候,咖啡因含量最如下圖4所示.

2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)咖啡因含量提取的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品(精確至 0.000 1 g),分別按(10,15,20,25,30 min)超聲時(shí)間進(jìn)行提取,其他按實(shí)驗(yàn)步驟1.3.3進(jìn)行提取,測定條件按照1.3.1進(jìn)行測定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)超聲提取時(shí)間為25 min時(shí),咖啡因提取達(dá)到最大,含量為10.52 mg/g. 當(dāng)超聲波時(shí)間超過25 min后,咖啡因提取含量反而降低,這可能是由于功率時(shí)間太久,導(dǎo)致咖啡因損失.如圖5所示.

2.2.4 不同提取功率對(duì)咖啡因含量提取的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品(精確至 0.000 1 g),分別按(540、630、720、810、900 W)超聲功率進(jìn)行提取,按實(shí)驗(yàn)步驟1.3.3進(jìn)行提取,測定條件按照1.3.1進(jìn)行測定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)超聲提取時(shí)間為720 W時(shí),咖啡因提取達(dá)到最大,含量為14.36 mg/g.當(dāng)超聲波功率達(dá)到100%時(shí),咖啡因提取含量反而降低,這可能是由于功率太激烈導(dǎo)致咖啡因受到超聲波機(jī)械剪切力而分解.如圖6所示.

2.2.5 樣品加標(biāo)回收率、穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)

取茶葉1.000 g加入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 100 μg/mL 1 mL,加入提取溶劑,按1.3.3試驗(yàn)方案進(jìn)行提取供試液進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn),平行測6次,平均回收率為91.31%～108.24%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.71%～2.46%.

取同一批武夷巖茶供試品溶液,分別于 0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)行指紋圖譜測定,同時(shí)考察咖啡因含量的變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過24 h咖啡因的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.13%和咖啡因含量的RSD為0.73%.說明供試液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定.

取同一批武夷巖茶供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖.結(jié)果表明,咖啡因的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.030%和咖啡因含量的RSD為0.73%.說明供試液精密度良好.

取同一批武夷巖茶供試品5份,按按照實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1進(jìn)行提取與測定.結(jié)果表明,咖啡因的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.021%和咖啡因含量的RSD為2.20%.說明提取方法重現(xiàn)性良好.

2.3 不同產(chǎn)地、不同加工過程茶葉中咖啡因含量變化

準(zhǔn)確茶葉樣品 1.000 0 g(精確至 0.000 1 g),按實(shí)驗(yàn)步驟1.3.3進(jìn)行提取,測定條件按照1.3.1進(jìn)行測定.如圖7所示,不同產(chǎn)地不同加工工藝過程中茶葉中咖啡因含量變化有所不同,總體來說,茶青中咖啡因含量比較少,經(jīng)過萎凋、搖青、殺青、捻揉后,茶葉中咖啡因含量逐漸增大,最后加工到毛茶茶葉時(shí)候,咖啡因含量急劇減少[14].這個(gè)可能是在毛茶工藝時(shí)候,由于需要對(duì)茶葉進(jìn)行高溫制茶,導(dǎo)致了茶葉中咖啡因由于高溫,咖啡因升華,含量急劇減少,如圖7所示.

2.4 聚類分析

根據(jù)表圖7所示,運(yùn)用SPSS的PASWStatistics18軟件數(shù)據(jù)處理,軟件處理：采用系統(tǒng)聚類分析方法,以咖啡因含量為變量,聚類方法采用組間鏈接法,度量標(biāo)準(zhǔn)采用平方Eudidean距離,對(duì)8個(gè)武夷巖茶茶葉樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(可變類平均法)分析,得到武夷巖茶茶葉樣品聚類圖,如圖8所示.武夷巖茶茶葉可以將其分為2大類,以茶葉6、8號(hào)樣品為第1類,另外6號(hào)樣品為第2類；同時(shí)可為第2類再細(xì)分,可得2個(gè)亞類,茶葉1、3、5號(hào)樣品為第1亞類,另外茶葉2、4、7號(hào)樣品為第2亞類.其中,1～8號(hào)武夷巖茶的茶葉分別為烏龜山的肉桂、大口坑的肉桂、曼陀峰的肉桂、東山的水仙、百花巖的水仙、洲地的水仙、雞母壟的奇丹、烏龜山的奇丹.

3 結(jié)語

通過單因素實(shí)驗(yàn)考察了超聲波提取功率和提取時(shí)間、凈化劑和提取溶劑的選擇,并采用高效液相色譜法測定茶葉中的咖啡因含量,同時(shí)對(duì)于咖啡因的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性進(jìn)行評(píng)價(jià).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為溶劑、超聲波時(shí)間為 25 min,提取功率720 W,采用無水Na2SO4和大孔樹脂作為凈化劑為提取茶葉中的咖啡因,說明供試液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定、精密度、提取方法重現(xiàn)性良好.

武夷巖茶在加工過程中,經(jīng)過萎凋、搖青、殺青、捻揉后,茶葉中咖啡因含量逐漸增大且呈現(xiàn)遞增趨勢,由原先鮮葉的咖啡因含量5～15 mg/g增加到捻揉的咖啡因含量20～30 mg/g.由于在毛茶加工過程中,溫度上升到200～220 ℃.茶葉中咖啡因由于高溫,發(fā)生升華、分解、揮發(fā)、破壞,使得茶葉中含量急劇減少[14].

通過聚類分析,對(duì)8個(gè)不同產(chǎn)地、加工工藝過程中發(fā)現(xiàn)茶葉中咖啡因具有較大差異,且具有明顯的地區(qū)特征.對(duì)不同產(chǎn)區(qū)武夷巖茶茶葉中咖啡因比較研究,為區(qū)別不同產(chǎn)地武夷巖茶品質(zhì)提供一定的參考.以咖啡因含量為指標(biāo),可能可以作為區(qū)分武夷巖茶產(chǎn)地的關(guān)鍵性指標(biāo)之一.