張玉 高鳳云 謝文婷

摘 要：泰樂菌素是一種專門用于畜禽抗感染和促生長的抗生素，不會引發(fā)交叉耐藥性問題，而且附加值高，但隨著市場需求的與日俱增，需要不斷提高其質(zhì)量與產(chǎn)量。對此，筆者基于弗氏鏈霉菌TP-116菌種，經(jīng)復(fù)合誘變處理對其作了泰樂菌素粉抗性定向篩選，所得菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性和較高的發(fā)酵效價，達到了選育培優(yōu)的目的。

關(guān)鍵詞：泰樂菌素;弗氏鏈霉菌;誘變

目前泰樂菌素高產(chǎn)菌株培育方法有多種選擇，本文則綜合利用了微波、紫外線以及氯化鋰的誘變方法，以期改善泰樂菌素性能，提高其生產(chǎn)能力，更好的服務(wù)于畜禽行業(yè)發(fā)展。

1 泰樂菌素高產(chǎn)菌株的選育培優(yōu)實驗

1.1 材料要求

首先，選取以具有較強生產(chǎn)能力的弗氏鏈霉菌TP-116菌株作為本次實驗的出發(fā)菌。其次，制備平皿與斜面培養(yǎng)基時，控制FeSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、瓊脂、可溶性淀粉配比分別為0.002%、0.1%、0.1%、0.5%、2.0%、3.0%，經(jīng)純化水配制后調(diào)整pH值為6.8-7.2。再者，制備種子搖瓶培養(yǎng)基時，控制輕質(zhì)碳酸鈣、豆油、冷榨黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉配比分別為0.6%、0.9%、1.2%、1.2%、1.3%，經(jīng)純化水配制后調(diào)整pH值為6.8-7.2。最后，制備發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基時，控制MnCl2、NiSO4·6H2O、（NH4）2HPO4、鹽酸甜菜堿、Na Cl、KCl、輕質(zhì)碳酸鈣、棉籽蛋白、麩質(zhì)粉、魚粉、玉米淀粉、豆油分別為0.0026%、0.0036%、0.12%、0.15%、0.5%、0.5%、0.6%、1.3%、1.68%、2.08%、3.21%、6.2%，經(jīng)純化水配制后調(diào)整pH值為6.9-7.3。

1.2 培養(yǎng)條件

泰樂菌素高產(chǎn)菌株的選育在不同階段需要不同的培養(yǎng)條件，其中斜面培養(yǎng)要求保證28±0.5℃的培養(yǎng)溫度、20-50%的相對濕度以及300-420h的培養(yǎng)時間;種子搖瓶培養(yǎng)要求保證28±0.5℃的培養(yǎng)溫度、20-50%的相對濕度、36-42h的培養(yǎng)時間以及360±20rpm的轉(zhuǎn)速;發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)則需要保證27±0.5℃的培養(yǎng)溫度、35-50%的相對濕度、200-240h的培養(yǎng)時間以及360±20rpm的轉(zhuǎn)速[1]。

在此基礎(chǔ)上選取ODS柱為色譜柱，以氯化鈉（0.85mol/L）和乙腈溶液（40%）為流動相，經(jīng)鹽酸（1mol/L）調(diào)整pH值為2.5后，配以290nm的檢測波長和1mL/min的流速，根據(jù)（標(biāo)準(zhǔn)品單位·待測樣品峰面積·待測樣品稀釋倍數(shù)）/標(biāo)準(zhǔn)品峰面積=待測效價這一公式測定泰樂菌素的效價[2]。

1.3 誘變處理

1.3.1 復(fù)壯處理原始菌株

完成孢子懸液制備后將無菌水加入其中進行稀釋至1×10-5，隨后吸取每個培養(yǎng)皿中稀釋的孢子懸液20μL在平皿培養(yǎng)基平板中均勻涂布，使其在27℃溫度下培養(yǎng)5d，選擇其中的單菌落用于搖瓶初篩與復(fù)篩，統(tǒng)計復(fù)壯數(shù)據(jù)。

1.3.2 紫外線誘變菌株

量取10mL制備好的孢子懸液置于滅菌平皿（直徑10cm）中，先對15W額定功率的紫外線燈進行25min的預(yù)熱，設(shè)置253.7nm的波長，隨后將上述平皿置于磁力攪拌器上，與燈管保持30cm的距離，打開平皿蓋分別控制照射時間為0s（對照組）、30s、60s、90s、120s，并對泰樂菌素的致死率與正突變率加以計算和統(tǒng)計。

1.3.3 微波誘變菌株

量取10mL孢子懸浮液，注入10cm直徑的平皿中，設(shè)定微波爐脈沖頻率、運行功率分別為2450MHz和800W后輻照孢子懸液，處理時間分別為0s（對照組）、20s、40s、60s，并對泰樂菌素的致死率與正突變率加以計算和統(tǒng)計。

1.3.4 復(fù)合誘變菌株

以TP-108泰樂菌素菌株為對象，對其單孢子菌懸液進行紫外線誘變與微波誘變，經(jīng)合理稀釋后涂布于平皿培養(yǎng)基中，且該培養(yǎng)基中含有氯化鋰0.2%，并按要求設(shè)置對照組。

1.3.5 抗性定向篩選

稀釋誘變后的孢子懸液，隨后將其分別涂布于濃度一定的泰樂菌素培養(yǎng)基平板上，置于27℃溫度下培養(yǎng)6d，用于泰樂菌素抗性突變菌株的篩選。在后期測定遺傳穩(wěn)定性時，需斜面保存高產(chǎn)菌株，待孢子產(chǎn)生后經(jīng)接種竹簽刮取少量移至另一斜面作為一代，按照上述操作直至傳代4次，結(jié)束后一同對4代菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定遺傳穩(wěn)定性，重復(fù)3次。

2 泰樂菌素高產(chǎn)菌株的選育培優(yōu)結(jié)果

2.1 復(fù)壯與誘變結(jié)果分析

分析原始菌株復(fù)壯數(shù)據(jù)可知，初篩與復(fù)篩后效價較高的單菌落有5個，經(jīng)平板3次分離與3次轉(zhuǎn)接后得到了具有最高發(fā)酵效價的TP-108菌落，并將其作為誘變處理對象。出發(fā)菌株經(jīng)不同誘變處理后的結(jié)果不盡相同，其中經(jīng)紫外線60s照射和微波照射40s雙重誘變處理下的搖瓶效價最高，泰樂菌素的正突變率也最高。而菌株TP-108孢子懸浮液在紫外線和微波分別照射60s和40s加以誘變的基礎(chǔ)上稀釋，再涂布于含有0.2%氯化鋰的斜面培養(yǎng)基所得搖瓶效價提高了9%左右。

2.2 篩選泰樂菌素突變株

第一，先在培養(yǎng)基加入濃度不同的泰樂菌素粉，隨后涂布制備的孢子懸液至不同的斜面培養(yǎng)基平板上，置于27℃溫度下培養(yǎng)6d，在對所有平板中菌落的生長情狀況進行觀察的同時記錄未長菌落的泰樂菌素的最小作用濃度，以此得到其對弗氏鏈霉菌抑制濃度的最低值。第二，為獲得泰樂菌素高產(chǎn)菌株，本次實驗需要在紫外線等復(fù)合誘變的同時加入泰樂菌素粉加以定向篩選，即選擇YB-08菌株為出發(fā)菌株，在培養(yǎng)基中加入濃度不同的泰樂菌素粉，隨后稀釋孢子懸液將其分別涂布于不同的平皿培養(yǎng)基平板上，置于27℃溫度下培養(yǎng)6d，觀察并記錄菌落的生長情況，得到0.1、0.3、0.6、1、3、5（μg/mL）的泰樂菌素粉的生長情況分別為好、一般、差、無菌落、無菌落、無菌落，說明篩選平板上YB-08菌株的單菌落數(shù)量會隨著泰樂菌素粉濃度的增加而逐漸減少，當(dāng)其達到1μg/mL時便無單菌落出現(xiàn)，故泰樂菌素粉對YB-08菌株的抑制濃度最小值為1μg/mL。第三，在含有1μg/mL濃度泰樂菌素粉的斜面培養(yǎng)基平板上涂布稀釋后的YB-08菌株，得到抗性突變株共150株，經(jīng)搖瓶初篩后發(fā)現(xiàn)效價高于YB-08出發(fā)菌株的抗性株為30株，于是將其移至斜面作搖瓶復(fù)篩處理，測得抗性突變株的平均效價有所提高，較之原始菌株提高幅度高達25%。

2.3 高產(chǎn)突變株的穩(wěn)定性

為進一步驗證泰樂菌素高產(chǎn)突變株是否符合高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的條件，在此就其穩(wěn)定性進行了試驗。即借助泰樂菌素粉抗性篩選操作得到Y(jié)BT-06、YBT-12、YBT-20三株優(yōu)良菌株，將其保存于斜面用于生產(chǎn)孢子，經(jīng)接種竹簽刮取少量孢子移至另一斜面作為一代，如此傳代4次，結(jié)束后一同對4代菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定遺傳穩(wěn)定性，重復(fù)3次。最終得到如下數(shù)據(jù)，即YBT-06的初始、第一代、第二代、第三代、第四代的效價（μg/mL）分別為11066、10000、9986、11036、11068;YBT-12的初始、第一代、第二代、第三代、第四代的效價（μg/mL）分別為11200、9632、8798、7692、7356;YBT-20的初始、第一代、第二代、第三代、第四代的效價（μg/mL）分別為11320、10021、9365、8342、7863。分析可知，初篩所得的正突變菌株經(jīng)傳代復(fù)篩后部分菌株出現(xiàn)退化，說明泰樂菌素高產(chǎn)菌株遺傳特性不太穩(wěn)定，容易退化，而在傳統(tǒng)復(fù)合誘變法的基礎(chǔ)上加入泰樂菌素粉抗性篩選法，不僅解決了誘變隨機篩選的不定向和盲目性的問題，改善了工作效率，還篩選出了YBT-06這一泰樂菌素高產(chǎn)菌株，且其搖瓶發(fā)酵效價高于原始菌株25%，為泰樂菌素的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)束語

本文通過紫外線、微波與氯化鋰誘變處理弗氏鏈霉菌，結(jié)合使用泰樂菌素粉抗性定向篩選，最終所得高產(chǎn)菌株生產(chǎn)力強、發(fā)酵效價高、遺傳穩(wěn)定性好，符合選育培優(yōu)的條件，值得借鑒和推廣。

參考文獻：

[1]劉鵬，徐雪風(fēng)，陸建中，王維興.泰樂菌素高產(chǎn)菌株誘變選育[J].當(dāng)代化工研究，2019（15）：111-112.

[2]丁亞蓮，李春玲，黨紅娟，高宏偉，張萍.應(yīng)用基因組重排技術(shù)提高泰樂菌素產(chǎn)量[J].中國抗生素雜志，2017，42 （10）：902-909.