符 東,龔燕川,劉 帥,況利騰,青周林,王 曦,何照春,肖亞婷

（四川文理學(xué)院1.化學(xué)化工學(xué)院;2.特色植物開發(fā)研究四川省高校重點實驗室,四川 達州635000）

喹諾酮類藥物是21 世紀以來發(fā)展迅速的一類廣譜抗生素,具有抗菌譜廣、抗菌活性強、高效、毒副作用小等特點,在醫(yī)學(xué)特別是獸醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用.恩諾沙星又為乙基環(huán)丙沙星,是人工合成的第3 代氟喹諾酮類抗菌藥,具有抗菌譜廣、殺菌力強、毒副作用小、半衰期長、體內(nèi)分布廣、價格低廉、與其他抗生素之間無交叉耐藥性等特點,被廣泛應(yīng)用于家禽、畜牧、魚、蝦、蟹水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中,在預(yù)防疾病感染和促進生長方面效果較好.［1-4］近年來,由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被濫用,導(dǎo)致在水產(chǎn)品中富集,并通過生物鏈累積,使其殘留濃度加大,進而對人體產(chǎn)生危害.［5,6］Ramirez A J 等人［7］研究發(fā)現(xiàn),喹諾酮類抗生素會嚴重損傷人體的消化吸收系統(tǒng);Cabello F C［8］研究表明,恩諾沙星在人體中達到一定的濃度,會產(chǎn)生致癌、致畸等作用;梁惜梅等人［9］研究珠江口水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)抗生素殘留發(fā)現(xiàn),水產(chǎn)品中恩諾沙星蓄積作用可對人體肝腎造成損害,濃度越大受損越嚴重.

目前,對恩諾沙星檢測的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LCMS）、酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光分析法和熒光光譜法等.［10-14］高效液相色譜法結(jié)果準確,但前期處理方法復(fù)雜、檢測周期長、儀器成本高等;酶聯(lián)免疫分析法特異性強、靈敏度高,但前期處理工作特別是對試劑盒的制備要求繁瑣苛刻;化學(xué)發(fā)光分析法分析速度快、靈敏度高,但檢測體系不穩(wěn)定,易受發(fā)光時間等因素影響;熒光光譜法具有靈敏度高、方法簡單、重現(xiàn)性好、設(shè)備簡單等優(yōu)點,目前已報道的分析恩諾沙星殘留的熒光光譜法,面臨靈敏度低、選擇性低、檢測體系不穩(wěn)定等缺點.因此急需一種設(shè)備成本低、操作方便快捷、靈敏度高、檢測體系穩(wěn)定的分析新手段用于恩諾沙星的檢測.

本論文以CdTe 量子點為反應(yīng)底物,在一定技術(shù)上制備成CdTe-Al 熒光探針,與恩諾沙星結(jié)合形成CdTe-Al-恩諾沙星體系,且恩諾沙星具有共軛結(jié)構(gòu)和剛性,適合于熒光檢測分析.CdTe-Al 熒光強度較弱,但Al3+能顯著增強恩諾沙星的熒光強度,且CdTe-Al-恩諾沙星體系是牢固的配合物結(jié)構(gòu),大大增強了恩諾沙星的熒光強度,體系更穩(wěn)定,不受外界共存物質(zhì)的影響.對小龍蝦中恩諾沙星殘留檢測具有效果較好,靈敏度高、成本低等優(yōu)點,建立了痕量檢測小龍蝦中恩諾沙星殘留的新方法.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

759CRT 型紫外可見分光光度計（上海菁華科技有限公司）、F-4500 型熒光分光光度計（日本日立公司）、megafuge 8R 型臺式高速冷凍離心機（美國thermo 公司）、FSH-2A 型高速勻漿機（常州友聯(lián)儀器研究所）、PHS-3E 型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、DS－3510DTH 型超聲波提取儀（上海生析超聲儀器有限公司）等;

恩諾沙星標準品（BR,上海阿拉丁試劑有限公司）、乙腈（色譜純）、六水三氯化鋁、二氧化碲、水合氯化鎘、冰乙酸、醋酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉等試劑均為分析純.

1.2 CdTe-Al 熒光探針的制備

參照元曉云等人［15-17］的方法制備CdTe-Al并進行改進.把1.0 mmol 的水合氯化鎘與2.4 mmol 巰基乙酸加入磁力攪拌中攪拌,先用氫氧化鈉把溶液pH 調(diào)到11.0,加入一定量的鹽酸羥胺后再用氫氧化鈉把溶液pH 調(diào)到11.0,然后加入0.01 mmol 的二氧化碲,在200 ℃油浴中反應(yīng)25 min 后,冷卻,加入乙醇沉降分離后溶于水中,向水溶液中加入0.02 mmol 的六水三氯化鋁和適量醋酸,在100℃磁力攪拌器中反應(yīng)30 min后即得CdTe-Al 配合物,經(jīng)紫外-可見和熒光光譜鑒定,配合物未出現(xiàn)獨立個體的光譜特征,說明制備的CdTe-Al 熒光探針符合文獻要求.

1.3 樣品制備和處理

隨機在不同市場不同售賣點購置小龍蝦,去頭、去殼等組織,取處理好的食用部位絞碎制成勻漿樣品組織.參考Tao［18,19］等人的處理方法,并進行適當(dāng)改進.準確稱取5.00g 混勻的小龍蝦勻漿樣品組織置于10ml 離心管中,加入4.0mL 乙腈和0.04mL 冰乙酸提取液,高速勻漿1min, 超 聲 提 取10min, 于10000r/min 離 心10min,收集上清液,殘渣重復(fù)提取1 次,合并兩次上清液.常溫下氮氣吹干,再用pH 為3.5 的HAc-NaAc 緩 沖 溶 液2.0ml 溶 解 殘 渣, 用0.22μm 微孔濾膜過濾后各取2.0ml 至10.00ml容量瓶中定容備用.

1.4 恩諾沙星的檢測

取1.0ml 濃度 為1.0×10-4mol/L 的CdTe-Al加入到1.0ml 不同濃度量的恩諾沙星標準溶液中,用pH3.5 的HAc-NaAc 緩沖溶液定容至10.00 ml,室溫反應(yīng)25min 后,以激發(fā)波長325 nm,發(fā)射波長440 nm 測其熒光強度.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜特性

圖1 可看出,單獨的CdTe-Al 和恩諾沙星的熒光強度很弱,而CdTe-Al 與恩諾沙星作用后,熒光強度均明顯增加.在一定濃度范圍內(nèi),隨著恩諾沙星濃度的增加,其熒光強度逐漸增強,表明CdTe-Al 熒光探針能進行恩諾沙星的檢測.mg/kg、1.80×10-3mg/kg、2.52×10-3mg/kg、3.59×10-3mg/kg、4.67×10-3mg/kg 的CdTe-Al-恩諾沙星體系中恩諾沙星的濃度.

圖1 CdTe-Al 體系的熒光光譜

2.2 最佳CdTe-Al 濃度的確定

研究表明,在一定范圍內(nèi),隨著CdTe-Al濃度的增加,體系熒光強度也相應(yīng)增強.當(dāng)CdTe-Al 濃度過低時,體系加入少量恩諾沙星就能引起強烈的熒光效應(yīng),雖然檢測靈敏度提高,但其線性范圍變小;當(dāng)CdTe-Al 濃度過高時,體系熒光強度相對較強,此時加入的恩諾沙星所引起的熒光強度相對變化不明顯,檢測靈敏度降低.綜合考慮到檢測靈敏度和線性范圍的前提下,實驗體系加入CdTe-Al 溶液的濃度均為1.2×10-4mol/L.

2.3 緩沖液pH 值的影響

體系分別加入不同的緩沖溶劑進行考察緩沖劑種類和pH 值對體系熒光強度和穩(wěn)定性的影響,體系分別加入EDTA-Mcllvaine 緩沖液、HAc-NaAc 緩沖液、磷酸鹽緩沖液、氨-氯化銨緩沖液和Tris-HCl 緩沖液［20］結(jié)果表明,體系在酸性環(huán)境下熒光強度最大,最優(yōu)的為HAc-NaAc 緩沖溶液.

實驗以HAc-NaAc 作為體系的緩沖液,進一步考察體系熒光強度最大時的pH 值和體系穩(wěn)定性.結(jié)果如圖2 所示,當(dāng)pH 在3.0-3.8 時,體系熒光強度最強,pH 在2.9-3.8 范圍內(nèi)體系熒光強度變化較小,處于最穩(wěn)定狀態(tài),因此本實驗把pH3.5 作為最佳實驗條件.

2.4 溫度和時間的影響

在其它最優(yōu)實驗條件下考察實驗溫度對體系熒光強度和穩(wěn)定性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度在15-80℃范圍內(nèi)變化時,較低溫度對體系的熒光強度和穩(wěn)定性影響較小,但在室溫條件下,隨著溫度的升高,體系的熒光強度逐漸下降,溫度越高下降越明顯,初步發(fā)現(xiàn)在高溫條件下,破壞了CdTe-Al 量子點的結(jié)構(gòu)而發(fā)生解離.因此,本實驗體系溫度在室溫下進行.

同時考察了反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響,在60min 內(nèi),以每5min 為間隔測定熒光強度,結(jié)果如圖3 所示.發(fā)現(xiàn)體系在前15min 內(nèi)熒光強度有所變化,但隨著時間推移,特別是20min 后熒光強度最大且穩(wěn)定,并持續(xù)到60min不變化.因此,本實驗選擇在20min 對體系進行熒光測定.

圖3 反應(yīng)時間對體系熒光強度的影響

圖2 pH 值對體系熒光強度的影響

2.5 共存物的影響

在小龍蝦樣品中加入一定量的恩諾沙星,使其制備的樣品中恩諾沙星含量為1.80mg/kg,在本實驗樣品制備液中加入以下常見離子,濃度均為5×10-4mol/L,相對誤差不超±5%,結(jié)果如表1 所示,可知所加入的離子對測定結(jié)果影響相對較小,可忽略掉.

表1 共存物的影響

Ca2+Ba2+Mg2+Cu2+Fe3+3.56-2.51 1.33-4.12-4.66 Cd2+Pb2+Vc酒石酸草酸-1.31-0.95 0.81 3.06 1.97共存物 相對熒光強度誤差（%） 共存物 相對熒光強度誤差（%）

2.6 回歸方程和檢出限

在最佳因素條件下,建立體系的熒光強度對恩諾沙星濃度的標準曲線,結(jié)果如圖4 所示.由圖可知,在7.19×10-4mg/kg～3.59×10-3mg/kg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為:IF = 30.774C - 155.4,相關(guān)系數(shù)R2為0.9996,檢出限為1.44×10-4mg/kg,可看出該體系對恩諾沙星檢測的靈敏度很高,適合檢測小龍蝦組織中恩諾沙星殘留.

圖4 標準曲線

2.7 回收率和精密度測定

按照1.4 實驗方法分別測定樣品中恩諾沙星含量,然后向各樣品中分別加入一定量的恩諾沙星標準溶液,測定回收率.上述各樣品每次均做6 次平行測定,結(jié)果見表2. 回收率為98.5～104.0%,可知在B 市場A 賣點及C 市場B賣點所售賣的小龍蝦中殘留微量的恩諾沙星,而其他取樣的市場售賣點含極微量或不含恩諾沙星,初步考慮B 市場A 賣點及C 市場B 賣點所售賣的小龍蝦生長水質(zhì)方面有一定污染,污染源可能來自于養(yǎng)殖場排放的污水或排泄物;也有可能所喂食飼料含有恩諾沙星抗菌藥,用于促進生長和預(yù)防疾病等目的.建議對B 市場A 賣點及C 市場B 賣點所售賣的小龍蝦及生長區(qū)域進行嚴格監(jiān)督和管理,并避免長期食用這一區(qū)域的魚蝦等水產(chǎn)品.

表2 回收率和恩諾沙星的檢測結(jié)果

2.8 CdTe-Al 熒光探針機理探討

恩諾沙星在318nm 處有最大吸收峰,其熒光發(fā)射峰位于435nm,通過體系的吸收光譜和發(fā)射光譜得知,CdTe-Al 對體系的吸收光譜和發(fā)射光譜幾乎無影響.而CdTe-Al 與恩諾沙星作用后,恩諾沙星的最大吸收峰紅移到335nm,熒光發(fā)射峰紅移到442nm,且熒光強度大幅度增強,初步認定Al3+與恩諾沙星形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,增強了恩諾沙星內(nèi)源性熒光強度,進而增強體系的熒光強度.［21］進一步研究發(fā)現(xiàn),在溶液體系中加入一定量的乙二胺四乙酸二鈉螯合劑后,測定體系熒光強度,發(fā)現(xiàn)恩諾沙星的最大吸收峰藍移到330nm,熒光發(fā)射峰藍移到439nm,均未檢測到單獨的CdTe 和恩諾沙星特征吸收光譜和發(fā)射光譜,說明CdTe-Al-恩諾沙星體系是牢固的配合物結(jié)構(gòu),否則乙二胺四乙酸二鈉會競爭性與Al3+結(jié)合而產(chǎn)生單獨的CdTe 和恩諾沙星特征吸收光譜和發(fā)射光譜.

結(jié) 論

本實驗以CdTe-Al 熒光探針為研究對象,建立了CdTe-Al 熒光探針高靈敏檢測小龍蝦中恩諾沙星殘留的新方法,實現(xiàn)了對小龍蝦中殘留的恩諾沙星可視化檢測.與現(xiàn)有的測定方法相比較,該體系更穩(wěn)定,不受外界共存物質(zhì)的影響,且該方法具有操作簡單、檢測靈敏度高、成本低等優(yōu)點,適用于小龍蝦中恩諾沙星殘留的快速檢測分析.