荊艷艷， 李 芳， 王 毅， 王鵬飛， 董叢叢

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，鄭州 450002）

能源短缺、資源枯竭、環(huán)境惡化促使人類重視可再生能源的開發(fā)和利用［1］，氫能因其無污染、能耗低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［2］，被認(rèn)為是最有前景的能源之一［3］. 光合生物制氫的研究主要集中在制氫材料、制氫工藝和菌種篩選等方面［4-6］. 在光合產(chǎn)氫過程中，光合細(xì)菌生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗和氫氣生成同其他細(xì)菌一樣受多種因素的影響. 南京工業(yè)大學(xué)焦敏等采用改進(jìn)的自適應(yīng)遺傳算法研究了丙酮丁醇間歇發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)模型［7］；Taro等對(duì)生物質(zhì)熱解過程動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究［8］，確定了生物質(zhì)熱解的途徑；王通洲和高虹利用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和分布活化能模型［9］，比較了兩種玉米秸稈熱解的過程動(dòng)力學(xué)；山東理工大學(xué)崔洪友等考察了溫度和CO2壓力對(duì)水熱條件下CO2催化棉纖維水解制糖過程動(dòng)力學(xué)特性的影響［10］；李道義等建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型對(duì)牛糞批次和連續(xù)高溫干式厭氧發(fā)酵實(shí)際運(yùn)行進(jìn)行了動(dòng)態(tài)模擬［11］；楊艷霞等采用格子Boltzmann方法模擬了有機(jī)廢水溶液繞流附著有光合生物膜管束的流動(dòng)、傳質(zhì)及光合生物反應(yīng)等過程［12］，得出交叉排管有利于傳質(zhì)及生物降解；廖強(qiáng)等建立了光合細(xì)菌比生長(zhǎng)速率、基質(zhì)比消耗速率和比產(chǎn)氫速率關(guān)于底物初始濃度影響的數(shù)學(xué)模型［13］；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)張全國(guó)等研究了酸堿度對(duì)玉米秸稈酶解液光合生物產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)的影響，解釋了混合菌群的產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)特性［14-15］；此外還有部分研究者在蛋白質(zhì)、環(huán)境和食品微生物等領(lǐng)域［16-18］做了動(dòng)力學(xué)方面的一些開拓性的工作.

研究不同產(chǎn)氫條件對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物生成等方面的動(dòng)力學(xué)影響及相關(guān)數(shù)學(xué)模型具有重要指導(dǎo)意義. 實(shí)驗(yàn)利用課題組從污泥廢水中富集得到的光合菌群［19］，研究光合產(chǎn)氫過程光合細(xì)菌新陳代謝、底物降解和氫氣生成的相關(guān)關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)生物制氫效率的提高及工業(yè)化制氫奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用光合產(chǎn)氫菌種是由深紅紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）、莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomonas capsulata）、沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas pulastris）、類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）和莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus）組成的混合菌種［19］. 混合菌種的產(chǎn)氫培養(yǎng)基為：NH4Cl 0.4 g/L，MgCl20.2 g/L，酵母膏0.1 g/L，K2HPO40.5 g/L，NaCl 2 g/L，谷氨酸鈉3.5 g/L，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至中性.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在250 mL反應(yīng)瓶中按照體積比1∶4接入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的光合產(chǎn)氫混合菌種和產(chǎn)氫培養(yǎng)基，反應(yīng)瓶有效容積為200 mL，即光合產(chǎn)氫混合菌種40 mL，產(chǎn)氫培養(yǎng)基160 mL. 然后分別加入葡萄糖濃度5、10、20 mg/mL三個(gè)水平的產(chǎn)氫底物（即葡萄糖加入量分別是1、2、4 g），然后調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至7.0后，將產(chǎn)氫反應(yīng)器密封并置于MGC-250智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn). 培養(yǎng)箱內(nèi)光照強(qiáng)度3000 lx，溫度30 ℃.

1.3 測(cè)試方法

1.3.1 細(xì)胞干重 每12 h取光合產(chǎn)氫菌液樣品置于6000 r/min高速離心機(jī)離心，然后倒掉上清液，并在65 ℃下烘干至恒重，稱量獲得混合菌種細(xì)胞干重.

1.3.2 底物濃度 每24 h取樣，采用3，5-二硝基水楊酸比色法，利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品在540 nm波長(zhǎng)處的光密度值，對(duì)照葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品底物濃度.

1.3.3 產(chǎn)氫量 采用排水集氣法和氣相色譜測(cè)量產(chǎn)氫量.

1.4 動(dòng)力學(xué)模型

1.4.1 底物降解消耗模型 葡萄糖作為最常見的六碳單糖，廣泛存在于淀粉、纖維素、半纖維素等多糖中，是光合產(chǎn)氫主要原料之一. 研究探索葡萄糖作為產(chǎn)氫底物的消耗規(guī)律，有利于提高生物質(zhì)秸稈、糖蜜廢水、淀粉廢水等富含纖維素和淀粉類物質(zhì)的產(chǎn)氫能力. 底物葡萄糖濃度隨時(shí)間變化曲線為反S曲線，本文采用修正后的Logistic模型描述光合細(xì)菌產(chǎn)氫底物降解曲線，修正后的Logistic方程為：

式中：k為葡萄糖降解速率因子；Amax為葡萄糖最大消耗量，mg/mL；λ降解葡萄糖的降解延遲期，h；Mt為t時(shí)刻葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；M0為葡萄糖初始質(zhì)量濃度，mg/mL.

1.4.2 產(chǎn)氫模型 采用改進(jìn)的Gompertz方程［15］，使之適用于發(fā)酵產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)參數(shù)的擬合：

通過對(duì)上式微分可得到用于描述產(chǎn)氫氣速率的動(dòng)力學(xué)方程為：

2 結(jié)果與分析

2.1 光合產(chǎn)氫底物消耗規(guī)律

混合菌種光合產(chǎn)氫底物消耗規(guī)律及擬合曲線如圖1所示. 各濃度條件下，隨著光合細(xì)菌產(chǎn)氫代謝的進(jìn)行，葡萄糖逐漸被分解利用，一部分用于提供光合細(xì)菌自身代謝活動(dòng)的能量，一部分轉(zhuǎn)化為氫氣對(duì)外釋放，在整個(gè)產(chǎn)氫過程中葡萄糖的濃度不斷減小. 底物濃度5、10 mg/mL的反應(yīng)在120 h時(shí)葡萄糖濃度已經(jīng)相對(duì)較低，分別為0.379 3、0.949 4 mg/mL，而底物濃度為20 mg/mL的反應(yīng)在120 h時(shí)葡萄糖濃度仍達(dá)10.852 7 mg/mL，說明底物濃度是光合產(chǎn)氫的重要影響因素，混合菌種光合產(chǎn)氫分解利用葡萄糖合理的底物濃度為10 mg/mL.

利用修正的Logistic 模型對(duì)底物消耗進(jìn)行擬合得到的參數(shù)值見表1，底物濃度5、10、20 mg/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.998 8、0.997 2和0.982 7，均大于98%，說明修正的Logistic 方程適用于混合細(xì)菌光合產(chǎn)氫過程葡萄糖的消耗規(guī)律. 底物濃度20 mg/mL，葡萄糖最大消耗量為17.014 6 mg/mL，剩余未被利用的葡萄糖量較多. 5、10 mg/mL 的產(chǎn)氫系統(tǒng)，葡萄糖降解利用程度較高，底物濃度接近零. 20 mg/mL的系統(tǒng)，葡萄糖的降解延遲期最長(zhǎng)為100 h，其次是10 mg/mL，而5 mg/mL的降解延遲期最短為55 h. 表1和圖1同時(shí)說明，光合產(chǎn)氫底物濃度過大，不利于底物的轉(zhuǎn)化利用，而且降解延遲期較長(zhǎng)，因此底物濃度10 mg/mL較為合理.

圖1 光合產(chǎn)氫過程底物消耗動(dòng)態(tài)曲線Fig.1 The substrate consumption dynamic curve

表1 光合細(xì)菌底物消耗動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)Tab.1 The parameter estimates of substrate consumption dynamic

2.2 混合菌種光合產(chǎn)氫

不同底物濃度對(duì)光合細(xì)菌產(chǎn)氫的影響如圖2所示.光合細(xì)菌在24 h以后開始產(chǎn)氫，72 h內(nèi)的產(chǎn)氫量較低，隨后產(chǎn)氫量增長(zhǎng)迅速，168 h后產(chǎn)氫量基本穩(wěn)定，且在實(shí)驗(yàn)設(shè)置范圍內(nèi)，20 mg/mL的產(chǎn)氫量最大為551 mL，其次是10 mg/mL，而底物濃度為5 mg/mL 的產(chǎn)氫量最低僅230 mL. 從Gompertz模型所擬合的產(chǎn)氫曲線可以看出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和擬合值相差較小，Gompertz模型能較好地描述光合細(xì)菌產(chǎn)氫的過程.

表2給出了Gompertz模型擬合方程各項(xiàng)參數(shù)，底物濃度20、10、5 mg/mL 的Gompertz 模型擬合最大累積產(chǎn)氫量分別是588、409、233 mL，與實(shí)驗(yàn)測(cè)試數(shù)據(jù)誤差分別為6.715 1%、7.631 6%、0.869 6%. 根據(jù)Gompertz 模型計(jì)算獲得的最大產(chǎn)氫速率分別是6.637 9、4.168 7、4.102 7 mL/h，最大累積產(chǎn)氫量和最大產(chǎn)氫速率的變化趨勢(shì)一致，都是底物濃度20 mg/mL 的產(chǎn)氫系統(tǒng)最大.各濃度條件下，產(chǎn)氫延遲期的時(shí)間都在65～75 h之間，且相關(guān)系數(shù)R2均大于99%，說明Gompertz 模型對(duì)光合產(chǎn)氫過程擬合的非常好.

圖2 底物濃度對(duì)混合菌種產(chǎn)氫量的影響Fig.2 The influence of substrate concentration on hydrogen production

表2 產(chǎn)氫能力的Gompertz模型擬合參數(shù)Tab.2 The parameter of Gompertz model on hydrogen production

利用Gompertz模型擬合各參數(shù)獲得產(chǎn)氫速率的動(dòng)力學(xué)方程，繪制的產(chǎn)氫速率變化曲線如圖3所示. 各底物濃度下，產(chǎn)氫速率都呈先增大后減小的趨勢(shì)，80 h以前底物濃度5 mg/mL的系統(tǒng)產(chǎn)氫速率最小，底物濃度10、20 mg/mL的系統(tǒng)產(chǎn)氫速率大于5 mg/mL的系統(tǒng)且兩者差別不大. 80 h后，20 mg/mL系統(tǒng)的產(chǎn)氫速率繼續(xù)快速增高并于107 h達(dá)到最大，而底物濃度5 mg/mL和10 mg/mL的系統(tǒng)分別在95 h和101 h達(dá)到最高，且底物濃度20 mg/mL 系統(tǒng)的最大產(chǎn)氫速率最高，即底物濃度較低，光合細(xì)菌對(duì)底物的消耗利用程度高，最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)的時(shí)間較早.

2.3 光合產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)過程對(duì)比分析

光合細(xì)菌累積產(chǎn)氫量和光合細(xì)菌生長(zhǎng)隨時(shí)間變化規(guī)律符合S形曲線［20］，而光合細(xì)菌產(chǎn)氫代謝過程中底物消耗規(guī)律為反S 曲線. 底物濃度為10 mg/mL 的光合產(chǎn)氫系統(tǒng)，12～48 h 光合細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生物量增長(zhǎng)迅速. 隨著生物量增加，系統(tǒng)內(nèi)的整體代謝活動(dòng)增強(qiáng)，底物葡萄糖濃度下降，且24～48 h葡萄糖濃度下降程度大于12～24 h. 反應(yīng)12～48 h，光合細(xì)菌將葡萄糖底物從細(xì)胞外擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)在氫酶的作用下代謝生成氫氣，但生物體內(nèi)代謝活動(dòng)轉(zhuǎn)化的能量主要用于光合細(xì)菌自身的生長(zhǎng)代謝作用，導(dǎo)致產(chǎn)氫體系已經(jīng)有氫氣的生成，但數(shù)量較少. 葡萄糖消耗量主要集中在48～120 h，此時(shí)底物濃度降低程度最大，且光合細(xì)菌產(chǎn)氫速率較高，系統(tǒng)氫氣的生成主要在此時(shí)段，即光合細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期是底物消耗和氫氣生成的主要階段. 120 h以后光合細(xì)菌生物量開始減少，底物葡萄糖大部分已經(jīng)被消耗分解，產(chǎn)氫速率下降，累積產(chǎn)氫量增加緩慢（圖4）.

圖3 Gompertz模型擬合計(jì)算的產(chǎn)氫速率Fig.3 Hydrogen production rate of Gompertz model calculation

圖4 發(fā)酵產(chǎn)氫動(dòng)力學(xué)過程對(duì)比分析Fig.4 Analysis of hydrogen production process kinetics

3 結(jié)論

1）修正的Logistic 模型對(duì)底物消耗進(jìn)行擬合的相關(guān)系數(shù)均大于98%. 底物濃度20 mg/mL 的產(chǎn)氫反應(yīng)，最大底物消耗量較低為17.014 6 mg/mL，底物濃度為5、10 mg/mL 的系統(tǒng)，葡萄糖消耗利用程度較高. 而且5 mg/mL 的產(chǎn)氫系統(tǒng)底物降解延遲期最短，其次是10 mg/mL，底物濃度20 mg/mL 的底物降解延遲期最長(zhǎng)為100 h. 即光合產(chǎn)氫過程，底物濃度過大，不利于基質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用，10 mg/mL的底物濃度較為合理.

2）底物濃度為5、10、20 mg/mL 的產(chǎn)氫系統(tǒng)，模型擬合的產(chǎn)氫量與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相差較小，相關(guān)系數(shù)均大于99%. 產(chǎn)氫延遲期都在65～75 h之間，且產(chǎn)氫速率分別在95、101、107 h達(dá)到最大，說明底物濃度低，光合細(xì)菌對(duì)底物的消耗利用程度高，最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)時(shí)間較早.

3）光合產(chǎn)氫過程，累積產(chǎn)氫量和細(xì)菌生長(zhǎng)隨時(shí)間變化規(guī)律符合S形曲線，而底物消耗規(guī)律為反S曲線.反應(yīng)12～48 h，細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，底物濃度下降，此時(shí)生物體內(nèi)代謝活動(dòng)轉(zhuǎn)化的能量主要用于光合細(xì)菌自身的生長(zhǎng)代謝作用，產(chǎn)氫量較少；反應(yīng)48～120 h，底物消耗程度增大，光合細(xì)菌產(chǎn)氫速率較高，即光合細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期前期是底物消耗和氫氣生成的主要階段.