周志云，楊 靜，李 翠，胡 科，楊曉莉△

（1. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061； 2. 陜西盛德泰林生物安全技術(shù)檢測(cè)有限公司，陜西 西安 710061）

水分含量是反映藥品質(zhì)量安全和穩(wěn)定的一個(gè)重要參數(shù)［1-4］。水分活度（Aw）是指食品或藥品等物質(zhì)在密閉容器中達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)的水分蒸氣壓與該溫度下純水的飽和蒸氣壓的比值［4-5］。微生物的生長(zhǎng)必須有水，但結(jié)合在分子內(nèi)的水不能被微生物利用，只有游離的水才能被利用［6］，故采用水分活度來(lái)表示能被微生物利用的實(shí)際含水量，控制水分活度可抑制微生物的生長(zhǎng)。各類(lèi)不同的微生物與水分活度的關(guān)系主要體現(xiàn)在臨界點(diǎn)上，低于此臨界點(diǎn)，微生物不能生長(zhǎng)［7］。通過(guò)不同的介質(zhì)優(yōu)化產(chǎn)品處方，設(shè)計(jì)和控制藥品的水分活度，可降低微生物增殖的風(fēng)險(xiǎn)?！睹绹?guó)藥典》首次收載水分活度測(cè)定應(yīng)用于非無(wú)菌制劑微生物控制的章節(jié)［8］，將其成功引入制藥工業(yè)藥品微生物控制，但目前《中國(guó)藥典》對(duì)相關(guān)內(nèi)容收載較少。黑曲霉為曲霉屬真菌中的一個(gè)常見(jiàn)種屬，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，其生長(zhǎng)適溫為28 ℃左右，最低相對(duì)濕度為88%，能引起水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。黑曲霉可運(yùn)用在藥物發(fā)酵中，如在甘草發(fā)酵過(guò)程中可提高甘草甜素的提取率，但若生產(chǎn)不當(dāng)，則會(huì)產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素［9-10］。本研究中應(yīng)用氯化鈉、甘油、葡萄糖3 種不同介質(zhì)調(diào)節(jié)玫瑰紅鈉瓊脂的水分活度值，以降低黑曲霉可利用的“游離水”程度，從而達(dá)到使黑曲霉不再繁殖、生長(zhǎng)停滯的目的，并探討黑曲霉生長(zhǎng)所需的最低水活度值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、菌種與試藥

1.1 儀器

Aqualab Series 4 型水分活度儀（美國(guó)Decagon 公司）；HFsafe-1200 LC 型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；BS2202S 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為0.01 g）；IPP260 型霉菌培養(yǎng)箱（德國(guó)Memmer 公司）。

1.2 菌種

黑曲霉Aspergillus niger 標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，試驗(yàn)用菌株為第3 代。

1.3 試藥

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為170316）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為181124）；甘油（批號(hào)為20180730），氯化鈉（批號(hào)為20170308），D（ + ）-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)為20180109），聚山梨酯80（批號(hào)為20180821），均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 菌液制備

將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上，25 ℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的無(wú)菌0.9% 氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80 的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液，移至無(wú)菌試管內(nèi)，用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液制備成每1 mL 含黑曲霉104cfu 的孢子懸液。

2.1.2 培養(yǎng)基制備

玫瑰紅鈉平皿制備：分別稱(chēng)取氯化鈉、甘油、D（ +）-無(wú)水葡萄糖，調(diào)節(jié)玫瑰紅鈉培養(yǎng)基的水分活度至TL（0.76），T（0.77），TH（0.78），即黑曲霉生長(zhǎng)的水分活度限值為0.77，用不同介質(zhì)調(diào)節(jié)玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，使滅菌后的培養(yǎng)基的水分活度至最低水分活度附近3 個(gè)水平（即低于水分活度限值0.01 單位、水分活度限值、高于水分活度限值0.01 單位），同時(shí)配制不調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉培養(yǎng)基T0。

不同環(huán)境水分活度制備：稱(chēng)取氯化鈉、甘油、無(wú)水葡萄糖，置純化水中，調(diào)節(jié)各溶液水分活度至0.76，0.77，0.78，與玫瑰紅鈉瓊脂平皿水分活度相同。將121 ℃滅菌15 min 后的氯化鈉、甘油、無(wú)水葡萄糖溶液置密封干燥器中，制備不同環(huán)境水分活度儲(chǔ)存環(huán)境。

2.1.3 水分活度測(cè)定

預(yù)培養(yǎng)：無(wú)菌操作將濾膜正面朝上，貼于未調(diào)節(jié)水分活度滅菌后的玫瑰紅鈉瓊脂平板上。將制備好的菌液用接種針點(diǎn)植于濾膜中心位置，25 ℃預(yù)培養(yǎng)48 h。

觀察、轉(zhuǎn)移與分組：待菌落生長(zhǎng)至直徑為5～10 mm時(shí)，分別測(cè)量濾膜垂直的2 個(gè)直徑，取平均值，2 次測(cè)量差值不超過(guò)2 mm，記為初始大小。在生物安全柜內(nèi)將菌落連同濾膜小心轉(zhuǎn)移至制備好的不同梯度水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板上。TL（0.76），T（0.77），TH（0.78）為試驗(yàn)組；T0為對(duì)照組（0.95～0.97）。

培養(yǎng)：將滅菌后含有不同水分活度的鹽、甘油、無(wú)水葡萄糖溶液倒入干燥器內(nèi)，將玫瑰紅鈉平皿置含有相同水分活度鹽、甘油、無(wú)水葡萄糖溶液的密閉干燥器內(nèi)，置25 ℃培養(yǎng)、觀察。采取水分活度儀-露點(diǎn)/冷面鏡法直接測(cè)定調(diào)節(jié)水分活度［11］，于0，3，7，11，15，19，23，27，31 d 時(shí)分別測(cè)量并記錄菌落大小。每個(gè)驗(yàn)證試驗(yàn)分別進(jìn)行3 次。

2.2 結(jié)果

2.2.1 氯化鈉培養(yǎng)介質(zhì)

以氯化鈉為介質(zhì)，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 水分活度下菌落的生長(zhǎng)情況。結(jié)果未調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對(duì)照組）的黑曲霉生長(zhǎng)不受環(huán)境影響，第3 天超出測(cè)量范圍；其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調(diào)節(jié)水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉(zhuǎn)移至平板，前3 d，菌落處于適應(yīng)階段，有不同程度的增長(zhǎng)，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩(wěn)。水分活度低于0.77時(shí)，3 組黑曲霉菌絲均未出現(xiàn)增長(zhǎng)情況。當(dāng)水分活度調(diào)節(jié)至0.78 時(shí)，第1 次實(shí)驗(yàn)觀察至第23 天，黑曲霉菌絲直徑增長(zhǎng)0.5 mm；第2 次實(shí)驗(yàn)觀察至第31 天，黑曲霉菌絲直徑未增長(zhǎng)；第3 次實(shí)驗(yàn)觀察至第27 天，黑曲霉菌絲直徑增長(zhǎng)了1 mm。詳見(jiàn)圖1 A。因此，以氯化鈉調(diào)節(jié)水分活度來(lái)控制黑曲霉的增長(zhǎng)有顯著效果，水分活度控制在0.77 以下時(shí)，黑曲霉的增長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)。

2.2.2 甘油培養(yǎng)介質(zhì)

以甘油為介質(zhì)，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 不同水分活度下菌落的生長(zhǎng)情況。結(jié)果，未調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對(duì)照組）的黑曲霉生長(zhǎng)不受環(huán)境影響，第3 天超出測(cè)量范圍；其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調(diào)節(jié)水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉(zhuǎn)移至平板，前3 d，菌落處于適應(yīng)階段，有不同程度的增長(zhǎng)，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩(wěn)。水分活度低于0.77 時(shí)，3 組黑曲霉菌絲均未出現(xiàn)增長(zhǎng)情況。當(dāng)水分活度為0.78 時(shí)，第1 次實(shí)驗(yàn)觀察至第15 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第29 天，菌絲直徑增長(zhǎng)了1.5 mm；第2 次實(shí)驗(yàn)觀察至第25 天，黑曲霉菌絲呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了1.0 mm；第3 次實(shí)驗(yàn)觀察至第29 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了1.5 mm。詳見(jiàn)圖1 B。因此，以甘油調(diào)節(jié)水分活度來(lái)控制黑曲霉的增長(zhǎng)，水分活度控制在0.77 以下時(shí)，黑曲霉的增長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)；水分活度在0.78 時(shí)，菌絲雖有增長(zhǎng)，但變化不大，直徑只有1～1.5 mm 的增長(zhǎng)。

2.2.3 D（ + ）-無(wú)水葡萄糖培養(yǎng)介質(zhì)

以D（ + ）-無(wú)水葡萄糖為介質(zhì)，考察周期為31 d，記錄黑曲霉在0.76，0.77，0.78 不同水分活度下菌落的生長(zhǎng)情況。結(jié)果，未調(diào)節(jié)水分活度的玫瑰紅鈉瓊脂平板（對(duì)照組）的黑曲霉生長(zhǎng)不受環(huán)境影響，第3 天超出測(cè)量范圍，其余3 組玫瑰紅鈉瓊脂平板均調(diào)節(jié)水分活度，已接種黑曲霉的濾膜轉(zhuǎn)移至平板，前3 d，菌落處于適應(yīng)階段，有不同程度的增長(zhǎng)，3 d 后，菌落逐漸趨于平穩(wěn)。水分活度低于0.76 時(shí)，3 組黑曲霉菌絲均未出現(xiàn)增長(zhǎng)情況。當(dāng)水分活度調(diào)節(jié)至0.77 時(shí)，第1 次實(shí)驗(yàn)觀察至第23 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了8mm；第2 次實(shí)驗(yàn)觀察至第13 天，黑曲霉菌絲呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了1.5 mm；第3 次實(shí)驗(yàn)觀察至第19 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了1 mm。當(dāng)水分活度調(diào)節(jié)至0.78 時(shí)，第1 次實(shí)驗(yàn)觀察至第7 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了13mm；第2 次實(shí)驗(yàn)觀察至第17 天時(shí)黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了3 mm；第3 次實(shí)驗(yàn)觀察至第9 天，黑曲霉菌絲呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，至第31 天菌絲直徑增長(zhǎng)了1 mm。詳見(jiàn)圖1 C。因此，以D（ + ）-無(wú)水葡萄糖調(diào)節(jié)水分活度來(lái)控制黑曲霉的增長(zhǎng)，水分活度控制在0.76 以下時(shí)，黑曲霉的增長(zhǎng)處于停滯狀態(tài)；水分活度在0.77 以上時(shí)，菌絲呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖1 不同培養(yǎng)介質(zhì)下3 種水分活度黑曲霉生長(zhǎng)情況（ n=3）

3 討論

以氯化鈉為介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度為0.76～0.78 時(shí)，黑曲霉菌落直徑均無(wú)明顯變化。以甘油為介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度為0.76～0.77 時(shí)，菌落直徑無(wú)明顯變化；水分活度為0.78 時(shí)，菌落直徑增長(zhǎng)1～2 mm。D（ + ）-無(wú)水葡萄糖為介質(zhì)調(diào)節(jié)水分活度為0.76 時(shí)，菌落直徑無(wú)明顯變化；水分活度為0.77～0.78 時(shí)，黑曲霉菌落直徑增長(zhǎng)3～10 mm。不同介質(zhì)條件下，黑曲霉最低水分活度存在差異，其中氯化鈉調(diào)節(jié)下的黑曲霉菌落增長(zhǎng)不明顯，但通過(guò)甘油及葡萄糖調(diào)節(jié)后，水分活度在0.78 時(shí)即出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。可見(jiàn)，通過(guò)氯化鈉調(diào)節(jié)能獲得最低的黑曲霉生長(zhǎng)水分活度值。

黑曲霉菌絲測(cè)定采用的培養(yǎng)基為SDA，使用D（ +）-無(wú)水葡萄糖調(diào)節(jié)SDA 水活度平板不凝，分析原因可能是SDA 培養(yǎng)基處方中含有大量的葡萄糖［12］。但在配制水分活度為0.76 的SDA 平板時(shí)，需在原處方基礎(chǔ)上添加較大量的葡萄糖，這改變了培養(yǎng)基的特性，導(dǎo)致試驗(yàn)無(wú)法繼續(xù)。經(jīng)過(guò)各種試驗(yàn)研究后選用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，解決了水分活度較低的情況下平板不凝的問(wèn)題。

在藥品生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其是中藥材、中藥飲片、中藥顆粒經(jīng)常在運(yùn)輸及貯存過(guò)程中發(fā)生霉變［13］。因此，在非無(wú)菌藥品的配方開(kāi)發(fā)和保質(zhì)期研究中引入水分活度的概念十分有必要［14-15］，通過(guò)不同的介質(zhì)優(yōu)化產(chǎn)品處方，設(shè)計(jì)和控制藥品的水分活度，降低微生物增殖的風(fēng)險(xiǎn)是發(fā)展趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)水分活度不超過(guò)0.76 時(shí)，黑曲霉菌落生長(zhǎng)處于停滯期，這與文獻(xiàn)［8］的研究結(jié)果基本一致。